利用优势微生物抑制烟时霉变的研究
朱大恒 韩锦峰
郑州烟草研究院 郑州 450000 河南农业大学
摘要：试验研究了烟叶优势微生物对烟叶霉变的抑制作用。利用从烟叶中分离、纯化、培养出的优势微生物菌种对烟叶进行了抑霉试验。结果表明：从烤烟（C3F）中分离、筛选出5株优势微生物（M1、M2、M3、M4、M5）对培养基、烟丝和烟叶中霉菌的生长繁殖均有不同程度的抑制作用，以Ml菌株的抑霉作用最为显著。试验还对Ml菌株的生理生化特性进行了分析鉴定。这一研究结果为利用生物技术抑制烟叶霉变开辟了新途径。 关键词：烟叶 优势微生物 霉变 抑制
在烟叶仓储损耗中烟叶霉变占着很大的比例，造成的损失十分严重。烟叶在霉变过程中，霉菌分解烟叶成分，引起不利的物理和化学变化，使烟叶产生霉腐臭气，霉坏变质，严重影响烟叶的外观品质和香味品质，降低烟叶的使用价值。因此，防治烟叶霉变是一项极为重要的工作。
目前，在防治烟叶霉变方面的技术措施主要有控制烟叶入库水分含量、控制仓库空气相对湿度、定期翻垛、密封降氧、仓库喷洒化学药剂消毒、改善烟叶包装条件等。这些措施虽然对减少烟叶霉变起到一定作用，但在实际生产中，很难达到的理想的仓储环境条件，烟叶中的霉菌一旦遇到适宜的温湿度条件，烟叶就会发生霉变，并迅速蔓延。因此，尽管烟厂投入了大量的人力、物力和资金，烟叶霉变现象仍不能得到控制，仍然是目前各烟厂烟叶仓储中普遍存在的一大难题，亟待进一步研究和解决。 本文针对上述问题，首次提出了利用优势微生物抑制烟叶霉变的方法，旨在为有效防止仓储烟叶霉变，减少实际生产中人力、物力、资金消耗，减少经济损失开辟新途径；同时，为生物技术在烟叶仓储中的合理运用奠定理论基础。
1 材料和方法
1．1 材料
选用河南C3F等级烤烟，品种NC 1．2 试验方法
1.2.1 培养基类型 （1）查氏培养基：NaNO3 0.2％K2HPO4 0.1％；KCl 0.05％；MgSO4 0.05％；FeSO4 0.00l％；葡萄糖2.0％；琼脂1.5％。用于霉菌分离和纯化。（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％；蛋白胨10％；NaCl 0.5％；琼脂1.5％。用于优势菌分离和纯化。（3）豆芽汁葡葡糖琼脂培养基：新鲜豆芽：100g于烧杯中加水100mL，煮约半小时后过滤，加入50g葡萄糖、15g琼指。用于抑霉试验。 1.2.2 微生物分离、纯化、计数方法采用常规方法。
1.2.3 防霉试验 （1）培养基防霉试验：将分离、纯化的优势微生物分别接种在豆芽汁培养基上（设3个重复），于30℃培养24小时，待长出菌带后，于菌带外缘处采用划线法接种分离出来的霉菌，培养48小时后，以霉菌菌落外缘至优势菌菌带外缘的距离判断优势菌抑制霉菌的作用大小，筛选出的5株对霉菌抑制作用较强的菌株，代号M1、M2、M3、M4、M5，并对Ml进行形态和生理生化特性分析鉴定。（2）烟丝防霉试验：分别将筛选出的5株优势菌制成菌液（含菌量为106～107个／mL，以10％的用量均匀喷洒在烟丝上，对照以等量蒸馏水代替，然后于95％相对湿度、30℃条件下培养，分别培养2天、4天、6天观察烟丝霉变情况。（3）烟叶防霉试验：将筛选出的5株优势菌制成混合菌液（含菌量为107～108个／mL），以2％的用量均匀喷洒烟叶上，对照以等量蒸馏水代替，烟叶打包后于相对湿度为80％左右、温
度为15～30℃条件下存放半年，然后观察烟叶霉变情况，并测定烟叶霉菌数量。
2 结果与讨论
2．1 优势微生物对培养基中霉菌的抑制作用
通过大量的分离、筛选试验，从烤烟叶面微生物中选出了5株对霉菌有较明显抑制作用的优势菌株，分别为M1、M2、M3、M4、M5，它们对培养基中不同霉菌的抑制作用见表1。从表1可以看出，M2、M4和M5对黄曲霉有较强抑制作用；M1、M2、M3、M4、M5对黑曲霉有较强抑制作用；而M1和M5对灰绿曲霉有较强抑制作用。综合来看，M1和M5对霉菌的综合抑制作用较大。对M1的形态和生物生化特性进行了分析鉴定，结果列于表2。
表1 优势菌株对培养基霉菌的抑制作用
供试霉菌 黄曲霉 黑曲霉 灰绿曲霉 M1 2～5 ＞5 ＞5 M2 ＞5 ＞5 ＜l 菌带间距（mm） M3 M4 ＜1 ＞5 2～5 ＞5 ＜1 ＜1 M5 ＞5 ＞5 ＞5 表2 优势菌M1的形态及生理生化特征
项目 宽（mm） 长（mm） 革兰氏反应 形态 形成芽孢 芽孢位置 芽孢膨大 圆形芽孢 颜色 透明度 光学特性 菌落质地 接触酶 氧化酶 葡萄糖产气 葡萄糖产酸 木糖产酸 L-阿拉伯糖产酸 甘露醇产酸 水解淀粉 结果 0.7～0.8 1.5～3.5 ＋ 杆状 ＋ 中生－亚端生 － － 乳白色 不透明 无光泽 粘质 ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 项目 酪素分解 酪氨酸分解 厌氧琼脂生长 pH5.7生长 5％NaCl生长 7％NaCl生长 10％NaCl生长 最高生长温度 M-R反应 V-P反应 V-P肉汤pH＞7 V-P肉汤pH＜6 盐还原 利用柠檬酸盐 利用丙酸盐 脲酶试验 石蕊牛奶 过氧化化氢酶 形成吲哚 形成二羟丙酮 结果 ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － 50℃ － － － － ＋ ＋ － ＋ 还原 ＋ － － 2．2 优势微生物对烟丝霉变的抑制作用
M1、M2、M3、M4、M5对在30℃、高湿条件下烟丝霉变抑制作用试验结果表明（表3），在烟丝放置2天时，未加优势菌的烟丝（对照）开始出现轻微霉变，而用上述5种优势菌处理的烟丝均无霉变迹象；在烟丝放置4天时，对照烟丝已发生明显霉变，烟丝粘连，色泽暗淡，M3、M4处理烟丝开始出现轻微霉变，而M1、M2和M5处理烟丝仍未有霉变迹象；在烟丝放置6天时，对照烟丝已发生严重霉变，并散发出明显的霉腐气味，完全失去了使用价值，M2、M3、M4处理的烟丝霉变较轻，而M1、M5处理的烟丝仍无霉变，闻香纯净，无任何霉腐气味，可照常使用。
表3 优势菌株对烟丝霉变的抑制作用
培养天数 2 4 6 未加菌（对照） ＋ ＋＋ ＋＋＋ M1 － － － 加优势菌处理 M2 M3 M4 － － － － ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ M5 － － － 注：“－”表示无可见霉变：“＋”表示可见轻微霉变；“＋＋”表示可见明显霉变；“＋＋＋”表示可见严重霉变。
2．3 优势微生物对烟叶霉变的抑制作用
将M1、M2、M3、M4和M5制成混合菌液，均匀喷洒在烟叶上，在湿度较高的条件下存放半年后观察烟叶霉变情况，结果表明：未经混合菌液处理的对照烟叶在存放半年后，叶面出现了明显的霉斑和菌丝，闻香有明显的霉腐气味；而处理烟叶无霉斑，闻香保持纯正，无霉腐气味，说明利用优势微生物处理烟叶可起到显著的防霉效果。对烟叶霉菌数量测定结果进一步表明了这一作用（表4）。
表4 优势菌混合菌液对烟叶霉变的抑制作用
处理 未加混合菌液烟叶 加混合菌液烟叶 5.26×103 霉菌总数（个/g） 7.33×106 注：测定时间：烟叶存放半年
从以上研究结果可以看出，培养基防霉试验、烟丝防霉试验和烟叶防霉试验均表明，优势微生物对烟叶中的霉菌有明显的抑制作用。这一研究结果为烟叶仓储过程中霉变的防治开辟了新途径，在实际生产中，可考虑在烟叶复烤工序后段，打包或装箱前向烟叶喷施防霉菌液，达到防止烟叶仓储霉变的作用。此外，我们在试验研究中还发现，从烟叶中分离出的某些具有防霉作用的优势菌同时还具有改善烟叶香吃味品质的作用。因此，在实际生产中，利用筛选出的特定优势菌，有可能达到在防止烟叶霉变的同时、提高烟叶香吃味品质的双重效果，具有较大的研究和开发价值。
《中国烟草学报》，1999年，第2期，23～25页