碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究

第３０卷第３期　２０１１年９月　武汉工业学院学报　Ｖｏ１．３０Ｎｏ．３　Ｓｅｐ．２０１１　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｗｕｈａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　文章编号：１００９－４８８１（２０１１）０３－０００９－０５　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－４８８１．２０１１．０３．００３　碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究　万菡，刘良忠，李丁宁，刘培勇　（武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉４３００２３）　摘要：试验以新鲜鸡蛋蛋清为原料，以水解度（ＤＨ）作为试验衡量指标，利用ｐＨ—ｓｔａｔ法对　底物浓度、ｐＨ值、酶解温度、加酶量、酶解时间等试验条件进行考察，并采用正交试验综合分　析得到碱性蛋白酶酶解鸡蛋清制备蛋清肽的最佳工艺条件为：底物浓度４％；酶解ｐＨ值９．５；　酶解温度５５℃；加酶量６％；酶解反应时间４　ｈ，水解度可达２３．７４％。　关键词：蛋清；碱性蛋白酶；水解；水解度；肽　中图分类号：ＴＳ　２６４．２；Ｓ　６６１．６　文献标识码：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｆｒＯｍ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ＷＡＮ　Ｈａｎ，ＬＩＵ　Ｌｉａｎｇ－ｚｈｏｎｇ，　Ｄｉｎｇ—ｎｉｎｇ，ＨＵ　Ｐｅｉ—ｙ０　（ＣｏＵｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００２３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｒａｗ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ａｎｄ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｆｏｒ　ａ　ｓｙｓｔｅｍ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅ　ＤＨ　ｗａｓ　ｒｅｇａｒｄｅｄ　ａｓ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒ　ｔｏｏｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　Ｏｉｌ　ｈｅ　ｆｔａｃｔｏｒｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐＨ　ｖａｌｕｅ，ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ，ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｌｋａｌａｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　４％，ｐＨ９．５，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５５℃，ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎ￣ａｔｉｏｎ　６％，ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｄｅｇｒｅｅ　Ｗａｓ　２３．７４％ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｈｙ—　ｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　４　ｈ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ；ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ；ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｐｅｐｔｉｄｅ　近年来，国内外学者对多种食物蛋白进行酶解，　制备蛋白酶解液，从中分离出不同的生物活性肽，研　究原料有大豆蛋白、肉类蛋白、乳酪蛋白、海洋蛋白　蛋白质是食物中最理想的优质蛋白质，它含有人体　所必需的多种氨基酸，且氨基酸组成配比均衡性好，　是机体利用率最高的一种蛋白质。但由于其受热易　凝固等性质，了它在食品加工中的广泛应　资源、废弃蛋白资源等¨】。蛋类作为食物蛋白质的　重要来源之一，也为生物活性肽的开发提供了良好　的原料　Ｊ。我国是禽业大国，但目前我国鸡蛋深　加工产品较少，加工品种也很有限。鸡蛋蛋清占蛋　内容物重的４５％—６０％左右，而蛋白中除水分外，　主要含有蛋白质，含量为８％ｍｌ１．６％［４－ｓ］。蛋清　收稿日期：２ｐ１０・１０－２７．修回日期：２０１１－０４－２０．　作者简介：万菡（１９８６一），女，硕士，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｈａｒｄ４５６＠１６３．ｃｏｎ１．　用【６　。将蛋清进行酶解，生产蛋清肽，使产品具有　低渗性、低致敏性、高稳定性和高溶解性，可以改善　鸡蛋蛋清蛋白质的功能性质，从而可将其应用于更　多的食品中　¨。本试验采用碱性蛋白酶对蛋清进　行水解制备蛋清肽，研究其制备技术，为蛋清在食品　通讯作者：刘良忠（１９６３一），男，教授，博士，Ｅ．ｍａｉｌ：１ｉｕ２０２２８８８＠１６３．ｃｏｒｎ　１０　武汉工业学院学报　２０１１年　领域的开发利用以及蛋清肽的工业化生产提供依　据。　定量的蛋清，将蛋清稀释至蛋白质浓度为５％，分　别在５０℃，６０℃，７０℃，８０℃，９０℃和沸水中水浴　一１材料与方法　１．１材料与试剂　２０ｍｉｎ变性，然后在相同的实验条件下进行酶解，用　ｐＨ—ｓｔａｒ法测定水解度。由水解度大小确定蛋清的　最适变性温度。　２．１．２蛋清蛋白质变性时间的确定　鸡蛋：灵星禽业集团提供；碱性蛋白酶：南宁庞　博生物工程有限公司；氢氧化钠，盐酸均为分析纯。　１．２仪器与设备　ＡＲ２１０４电子分析天平：奥豪斯国际贸易（上　海）有限公司；ＳｐＳ２００１Ｆ电子天平：梅特勒一托利多　（常州）称重设备系统有限公司；８５—２数显恒温磁　力搅拌器：金华市瑞华实验仪器厂；ＨＨ一２数显恒　温水浴锅：国华电器有限公司；ｐＨＳ一３Ｃ型精密ｐＨ　计：上海精密科学仪器有限公司；８４０１一ＩＩ多功能电　动搅拌器：天津市华兴科学仪器厂。　１．３水解度（Ｄｔｔ）的测定方法一ｐＨ—ｓｔａｔ法　蛋白质水解度定义为在水解过程中打开的肽键　占蛋白质肽键总数的百分比，是描述蛋白质水解程　度一个非常重要的指标。当蛋白质的酶水解过程在　ｐＨ　６．５以上进行时，质子化的氨基酸将解离。因　此，要保持反应体系的ｐＨ值不变，就必须加入碱　液，碱液的消耗量与水解的肽键数目成正比，根据消　耗碱液的体积和摩尔浓度即可计算出水解度ＤＨ。　称取一定量的蛋清蛋白，加适量蒸馏水溶于烧　杯中，配制成一定浓度的底物浓度，通过磁力搅拌器　搅拌１０　ｍｉｎ后转移到反应容器中，调节温度达到反　应所需温度后，调节底物的ｐＨ值达到所需ｐＨ值。　恒定后加人碱性蛋白酶进行水解反应，在保持温度　和ｐＨ值不变的情况下，测定整个反应过程中滴定　所消耗碱的量，从而计算出水解度的大小。　蛋白质的ＤＨ按下式计算：　ＤＨ％　＝Ｂ×Ｎｂ×　一　×Ｍ一　×（ｈ　址）　一　×　１００％．　式中：Ｂ：水解过程中所消耗的标准碱液量（ｍＬ）；　Ｎ　：标准碱液的浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；　１ｎＰＨ—ｐＫ　Ｏｒ－＂　一氨基的平均解离度，　＝　；　：底物蛋白质的质量（ｇ）；　ｈ　底物蛋白质中肽键总数（ｍｍｏｌ／ｇ）。　２制备蛋清肽的酶解工艺　２．１原料的预处理　２．１．Ｉ　蛋清蛋白质变性温度的确定　经消毒处理后的鲜鸡蛋打蛋分离出蛋清，称取　将蛋清稀释至蛋白质浓度为５％，在最佳温度　下水浴，时间分别为０　ｍｉｎ，５　ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ，１５　ｍｉｎ，２０　ｍｉｎ，２５　ｍｉｎ和３０　ｍｉｎ，然后在相同的实验条件下进　行酶解，用ｐＨ—ｓｔａｒ法测定水解度。由水解度大小　确定蛋清的最适变性时间。　２．２蛋清酶解工艺　２．２．１底物浓度的确定　经消毒处理后的鲜鸡蛋打蛋分离出蛋清，称取　一定量的蛋清，并将蛋清分别稀释至底物浓度为　２％，３％，４％，５％，６％和７％，在最适条件下变性处　理。变性处理后的蛋清，在酶的最适ｐＨ值９，最适　温度５０℃（厂家提供）下酶解，加酶量为５％，酶解　４ｈ。　２．２．２酶解ｐＨ值的确定　将蛋白质浓度为４％的蛋清蛋白在最适变性条　件下变性后，调整ｐＨ值分别为７．５，８．５，９．５，１０．５　和１１．５，在加酶量为５％，温度为５Ｏ℃时酶解４　ｈ。　２．２．３酶解温度的确定　将蛋白质浓度为４％的蛋清蛋白在最适变性条件　下变性后，调整温度分别为４ｏ℃，４５℃，５０℃，５５℃，　６０　ａ【＝和６５℃，在最适ｐＨ值９．５，加酶量为５％时酶　解４ｈ。　２．２．４加酶量的确定　将蛋白质浓度为４％的蛋清蛋白在最适变性条　件下变性后，调整加酶量分别为２％；３％；４％；５％　和６％，在最适ｐＨ值９．５和最适温度５５℃时酶解　４　ｈ。　２．２．５酶解条件的优化　采用正交试验设计研究底物浓度、ｐＨ值、酶解　温度、加酶量４个因素对蛋清水解度的影响，以确定　碱性蛋白酶水解的最佳条件。正交试验因素水平见　表１。　表ｌ酶解条件因素水平表　３期　万菡，刘良忠，李丁宁，等：碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究　续表　２．２．６酶解时间的确定　按照正交试验选出的最佳水解条件进行水解，　调整不同的水解时间（１　ｈ，２　ｈ，３　ｈ，４　ｈ，５　ｈ和６　ｈ），以水解度为指标确定最佳水解时间。　３结果与分析　３．１原料的预处理　新鲜蛋清的蛋白结构致密，含０．０５％的卵巨球　蛋白（蛋白酶抑制剂）和０．１％－－１．５％的卵抑制剂　（丝氨酸蛋白酶抑制剂）　】。因此，需要对蛋清蛋白　进行适当的处理，使其结构易于蛋白酶的作用，并使　酶失活。通常经过热处理的蛋清蛋白结构松散，肽　键暴露，蛋白酶抑制失活。　３．１．１　蛋清蛋白变性温度对水解度ＤＨ的影响　从表２可以看出，随着蛋清蛋白变性温度的升　高，水解度也相应的增大，温度为１００　ｏＣ时，水解度　达到最大值。因此，蛋白变性时选择沸水浴。　表２变性温度对水解度（ＤＨ）的影响　变性温度／￣Ｃ　５０　６０　７０　８０　９０　沸水　水解度ＤＩ－Ｉ／％１０．０５　１２．９０　１４．１５　１５．９７　１８．３７　２０．１８　３．１．２蛋清蛋白变性时间对水解度ＤＨ的影响　由表３可以看出，蛋清蛋白经过变性后，水解度　显著提高，在变性时间为１５　ｍｉｎ时，水解度最大，随　后水解度缓慢下降，因此选择蛋清蛋白的变性时间　为１５　ｍｉｎ。　表３变性时间对水解度（ＤＨ）的影响　变性时间／ｒａｉｎ　０　５　１０　１５　２０　２５　３０　水解度ＤＩ－Ｉ／％４．１４　１６．９８　１７．７４２０．６７２０．１６　１９．７６　１９．１８　３．２碱性蛋白酶酶解鸡蛋清的单因素试验　３．２．１蛋清蛋白底物浓度对水解度的影响　蛋清中蛋白质含量约为１０％，加热变性时会导　致蛋白凝固而形成凝胶状，不利于蛋白酶的作用，需　要进行适当的稀释，但蛋白浓度也不宜过低，否则会　降低生产效率　】。因此，本试验将蛋清蛋白稀释到　不同浓度，在其他试验条件相同的情况下酶解，结果　如图３所示。　由图３可以看出，随着底物浓度的增大，水解度　呈先增后减的状态。在底物浓度为４％时，水解度　底物浓度　殇　图３　底物浓度对水解度（ＤＨ）的影响　达到了最大，因此试验确定蛋清蛋白水解的底物浓　度为４％。　３．２．２酶解ｐＨ值对水解度的影响　ｐＨ值是酶促反应的主要条件之一，最适ｐＨ值　是酶水解反应的重要参数。环境ｐＨ值的变化影响　酶与底物的结合和催化，促进或抑制酶的活性和酶　促反应速度。因此，ｐＨ值过高或过低对酶促反应均　产生不利影响。如图４所示，随着ｐＨ值的增大，水　解度也呈先增后减的状态。ｐＨ值在７．５＿－９．５之间　时，水解度的增加比较明显，但当ｐＨ值大于９．５以　后，水解度的下降相对缓慢，因此试验确定酶解的最　适ｐＨ值为９．５。　图４　ｐＨ值对水解度ＤＨ的影响　３．２．３酶解温度对水解度的影响　温度对酶促反应的影响有两个方面，一方面温　度提高可以使反应速度加快，另一方面随着温度的　提高，酶失活速度也开始加快。这两方面的综合影　响导致酶解反应存在着最适温度，偏离最适值会降　低水解效果。由图５可知，在温度为５５℃时，水解　度最大，水解效果最好。　酶解溢皮／℃　图５酶解温度对水解度ＤＨ的影响　１２　武汉工业学院学报　２０１１年　３．２．４加酶量对水解度的影响　量的酶可以提高转化率，但酶成本较高，适当的添加　酶浓度越大，酶与蛋白质分子肽链接触的几率　可降低成本。综合考虑水解反应速度、蛋白质水解　增加，底物转化的能力也就相应的增加。所以高剂　度和生产成本之间的相互作用，确定本试验的加酶　量为５％。　３．２．５蛋清蛋白酶解的正交试验分析　为优化水解条件，本试验采用正交试验设计，研　究底物浓度，ｐＨ值，酶解温度和加酶量４个因素对　蛋清蛋白酶解的影响，确定蛋清蛋白酶解的最优工　２　３　４　５　艺参数。以水解度ＤＨ为衡量指标，选用正交表　加酶　／％　（３　）进行试验。试验结果如表４所示。　图６加酶量对水解度ＤＨ的影响　表４碱性蛋白酶酶解蛋清的正交试验结果　从表４可知，碱性蛋白酶酶解蛋清的最佳工艺　参数为Ａ：Ｂ：ｃ　Ｄ，，即底物浓度４％，ｐＨ值９．５，酶解　温度５５￣Ｃ，加酶量６％。４个因素对蛋清酶解的影　王　响大小是Ｄ＞Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即加酶量对水解度的影　０　１９　响最大，其次是底物浓度和ｐＨ值，酶解温度对水解　度的影响相对较小。　２　３　４　５　６　３．２．６酶解时间对水解度的影响　穗解时ｔ￣ｔ／ｈ　如图７所示，水解时间越长，水解越彻底，水解　图７酶解时间对水解度ＤＨ的影响　度不断升高，但是４　ｈ后，水解度几乎不再升高，因　此选取水解时间为４　ｈ。　３期　万菡，刘良忠，李丁宁，等：碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究　１３　］Ｊ２　　１Ｊ３　　１Ｊ４（上接第８页）　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎｄｕｓｔｒｉｌａ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ａｄｖ，１９９７，１５（３—４）：５８３—６２０．　Ｂａｙｅｒ　Ｅ　Ａ，Ｌａｍｅｄ　Ｒ，Ｈｉｍｍｅｌ　Ｍ　Ｅ．Ｔｈｅ　ｐｏ—　部分无法生长，有生长的菌株也没产生预期的明显　的水解圈。因此我们设计了２组平行实验，一组是　将菌接种到纤维素一刚果红培养基（即在ＣＭＣ—Ｎａ　培养基配方中增加了０．４　ｇ／Ｌ的刚果红）固体平板　上培养，另一组是将菌接种到ＣＭＣ—Ｎａ培养基上，　然后用刚果红染色法进行染色鉴定。理论上刚果红　ｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｃｅｎｕｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌｕ．　１ｏｓｉｃ　ｗａｓｔｅ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ—　ｎｏｌ，２００７，１８（３）：２３７—２４５．　沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验（第三　版）［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９．　鉴定培养基和刚果红染色法均应看见水解圈，但实　际上菌株在加了刚果红的培养基上的生长情况同纤　维素一刚果红培养基，而后一种方案确实达到了预　期效果——菌株生长状况较好，经染色后也都出现　了水解圈。原因可能是所加入的刚果红抑制了菌株　对ＣＭＣ—Ｎａ的利用，从而影响菌株的生长。　参考文献：　高克学，郭润芳，于宏伟，等．蚀木链霉茵　ＫＸ６耐热内切葡聚糖酶的产生及酶学性质研　究［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００９，２９（５）：８３　—８８．　岳思君，李学斌，李爱华，等．高酶活纤维素　分解茵分离筛选的研究［Ｊ］．安徽农业科学，　２００９，３７（１）：１１—１２，１５．　［１］　Ｂｈａｔ　Ｍ　Ｋ，Ｂｈａｔ　Ｓ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ