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中国兽药杂志2019年6月第53卷第6期ChineseJournalofVeterinaryDrug
doi：10．11751/ISSN．1002－1280．2019．06．03
HPLC－PDA法测定恩诺沙星注射液中
非法添加乙酰甲喹和水杨酸
121*111
李淑焕，李有志，冯涛，徐红玮，张琦薄永恒，
（1．山东省兽药质量检验所/山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250022；
2．山东省农业工程学院食品科学与工程学院，济南250100）
［收稿日期］2019－01－08［1002－1280（2019）06－0014－07［S859．83文献标识码］A［文章编号］中图分类号］
［摘要］建立了高效液相色谱法测定恩诺沙星注射液中非法添加乙酰甲喹、水杨酸含量的方法。
试验采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以0．025moL/L磷酸溶液－乙腈（85∶15，V/V）为流动相，流速为1．0mL/min，二极管阵列检测器进行全扫描和232nm波长测定。结果表明乙酰甲喹在0．5～20μg/mL范围内线性良好，Ｒ2=1．000，平均回收率为99．62%；水杨酸在1．0～50μg/mL范围内线性Ｒ2=1．000，可靠、重现性好，平均回收率为99．51%；ＲSD在0．07%～3．44%之间。本方法准确、良好，
可用于恩诺沙星注射液中非法添加乙酰甲喹、水杨酸的定性和定量检测。［关键词］乙酰甲喹；水杨酸；非法添加；测定；高效液相色谱法
DeterminationAdditionofMaquindoxandSalicylicAcid
inEnrofloxacinInjectionbyHPLC
BOYong－heng1，LIShu－huan2，LIYou－zhi1*，FENGTao1，XUHong－wei1，ZHANGQi1
（1．ShandongProvincialVeterinaryMedicineSupervisionInstitute（ShandongProvincialKeyLaboratoryofQualitySafetyＲiskAssessment
forLivestockandPoultryProducts），Jinan250022，China；2．CollegeofFoodScienceandEngineering，ShandongAgriculture
andEngineeringUniversity，Jinan250022，China）
Correspondingauthor：LIYou－zhi，E－mail：liyouzhi2009@126．com
Abstract：AmethodwasdevelopedandvalidatedforthecontentdeterminationofmaquindoxandsalicylicacidinenrofloxacininjectionbyHPLC．ItwastestedwithC18column，usingphosphorousacidsolution－methanol（85∶15，V/V）asthemobilephase．Theextractwavelengthwas232nmfromfullscan．Ｒesultsshowedthatthecalibrationcurveofmaquindoxwasgoodlinearbetweenthepeakareasandtheconcentrationsof0．5～20μg/mL，thecorrelationcoefficient（r）was1．000andthemeanrecoverywas99．62%；thecalibrationcurveofsalicylicacidwasgoodlinearbetweenthepeakareasandtheconcentrationsof1．0～50μg/mL，thecorrelationcoefficient（r）was1．000andthemeanrecoverywas99．51%；ＲSDwas0．07%～3．44%．Inconclusion，themethodwas
2017］13）基金项目：山东省地方标准制定（兽质监标发［作者简介：薄永恒，博士，从事兽药残留检测工作。通讯作者：李有志。E－mail：liyouzhi2009@126．com
中国兽药杂志2019年6月第53卷第6期ChineseJournalofVeterinaryDrug
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accurate，reliableandreproducible，andprovidedareliablewayfordetectingacetoquineandsalicylicacidadulteratedinenrofloxacininjection．
Keywords：acetylquine；salicylicacid；illegaladdition；determination；highperformanceliquidchromatography（HPLC）
恩诺沙星注射液收载于《中国兽药典》2015版第一部
［1］
，为广谱杀菌药，
对大肠杆菌、沙门氏菌等都有杀菌效用，主要治疗由此病菌引起的消化系统、呼吸系统疾病。乙酰甲喹商品名称为痢菌净
［2］
，兽医临床主要用于禽巴氏杆菌病、雏鸡白痢
等。水杨酸属于非甾体抗炎药，常用于缓解家畜的发烧、感冒时的体温升高及关节疼痛等症状
［3］
。当
前，某些不法兽药生产企业为了扩大恩诺沙星药物
的疗效，而隐蔽乙酰甲喹和水杨酸的使用，在恩诺沙星注射液中添加乙酰甲喹和水杨酸的现象时有发生，造成乙酰甲喹和水杨酸的混乱使用，且不能执行其休药期，最终造成动物性食品中残留乙酰甲喹和水杨酸的严重后果。目前，关于乙酰甲喹和水杨酸的含量检测方法的报道较多，主要包括紫外可见分光光度法、液相色谱法、液相色谱－串联质谱法等。由于兽药制剂之间的检测方法差距较大，检测量上不在同一个级别，而且药物成分之间存在相互干扰
［4］
，因此，
急需开发一种同时检测恩诺沙星、乙酰甲喹和水杨酸的的方法，用以检测恩诺沙星注射液中乙酰甲喹和水杨酸的存在。为利于地市县等兽药检验部门开展兽药非法添加的检验工作，本研究将建立科学、有效、简单的恩诺沙星注射液中非法添加乙酰甲喹和水杨酸的检测技术，以有效杜绝非法添加的问题。1材
料
1．1
仪器
Waters2695e高效液相色谱仪，配二极
管阵列检测器，美国Waters公司；XS－205电子天平，瑞士MettlerToledo公司。1．2
试剂与材料
甲醇、乙腈为色谱纯，
MerckKGaA公司，其余试剂均为分析纯；实验用水为milli－Q超纯水。乙酰甲喹对照品（中国兽医药品监察所，批号：H0401204，含量：99．6%）；恩诺沙星（中国兽医药品监察所，批号：H0081505，含量：99．5%）；水
杨酸（中国食品药品检定研究院，批号：130451－201203，含量：84．2%）。2方
法
2．1
色谱条件
色谱柱：WatersXBridgeC18色谱
柱，
（4．6mm×250mm，5μm）；流动相：0．025moL/L磷酸溶液∶乙腈=85∶15（V∶V）；流速1．0mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃；二极管阵列检测器参考条件：定性采集波长范围200～400nm；定量波长232nm。2．2溶液的制备2．2．1
供试品溶液
量取恩诺沙星注射液0．5mL，
置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL置50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。2．2．2
对照品溶液
称乙酰甲喹、水杨酸对照品
50mg（准确至0．01mg），置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取1mL置100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品工作液。2．2．3
系统适应性溶液
分别精密量取乙酰甲喹、
水杨酸对照品储备液100μL和200μL，置10mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，即得。2．2．4
阴性添加溶液
分别精密量取乙酰甲喹、水
杨酸对照品储备液适量，置10mL量瓶中，用阴性无添加的恩诺沙星注射液的供试品溶液稀释并定容至刻度。2．3方法学考察2．3．1
系统适用性试验
乙酰甲喹、水杨酸在试验
条件下完全分离，分离度均大于1．5，各化合物的色谱峰理论塔板数均大于5000，方法专属性良好。系统适应性溶液色谱图（图1）及相应对照品光谱图（图2）。
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图1
Fig1
乙酰甲喹（浓度10μg/mL）色谱图水杨酸（浓度20μg/mL）、
Chromatogramofsalicylicacid（20μg/mL）andacetoquine（10μg/mL）
图2
Fig2
乙酰甲喹、水杨酸光谱图
Spectrumofacetoquineandsalicylicacid
2．3．2线性范围精密称乙酰甲喹、水杨酸对照品1．000。结果表明在线性范围内，水杨酸、乙酰甲喹浓度与峰面积呈现良好的线性关系。2．3．3
峰纯度检查
对阴性空白添加样品的光谱
图中两个目标化合物进行峰纯度检查，结果见图4～图5和表1。结果显示，阴性空白在232nm处有吸收值，但与两个目标化合物有较大分离，分离度大于1．5，达到很好的分离，如图3，且各色谱峰的纯度角度均小于纯度阈值，表明此色谱条件下，两个目标化合物的出峰位置无其他干扰峰，为单一物质，方法可行。
50mg（准确至0．01mg），置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。用流动相分别配制水杨酸、乙酰甲喹的混合标准溶液5种，浓度分别20μg/mL、20、10μg/mL、10、5μg/mL、为50、
2、1μg/mL、1、0．5μg/mL。从低浓度到高浓度一次注入液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线，水杨酸、乙酰甲喹标准工作曲线回归方程分别为：y=35628．467x－4908．954、
2
y=58342．7x+2297．349，相关系数Ｒ分别为1．000、
图3
Fig3
水杨酸（浓度20μg/mL）、乙酰甲喹（浓度10μg/mL）的阴性添加溶液色谱图
Chromatogramofsalicylicacid（20μg/mL）andacetoquine（10μg/mL）innegativeadditionsolution
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图4
Fig4
阴性空白添加水杨酸的纯度图
Puritydiagramoftheadditionofsalicylicacidtothenegativeblank
图5
Fig5
阴性空白添加乙酰甲喹的纯度图
Puritymapofacetaminoquinaddedtonegativeblank
表1
Tab1
序列号123
名称
峰纯度检查结果表
PeakPurityCheckＲesultsTable
保留时间7．3588．65816．370
纯度角度0．1290．0410．397
纯度阈值0．9000．6204．717
纯度结果单一物质单一物质单一物质
乙酰甲喹恩诺沙星水杨酸
2．3．4灵敏度试验在阴性样品中添加乙酰甲喹、
水杨酸标准溶液，获得0．5μg/mL和0．25μg/mL的添加乙酰甲喹终浓度样品和1μg/mL和0．5μg/mL的添加水杨酸终浓度样品，进行检测，以光谱图失真的最大浓度作为方法的检出限
［5］
。水杨酸在
0．5μg/mL的添加终浓度下，光谱图已失真，如图6，因此，水杨酸的最低检出限浓度为1μg/mL，在恩诺沙星注射液中的检出限为0．5mg/mL；乙酰甲喹在0．25μg/mL的添加终浓度下，光谱图已失真，如图7，因此，乙酰甲喹的最低检出限浓度为0．5μg/mL，在恩诺沙星注射液中的检出限为0．25mg/mL。
图6
水杨酸的检出限光谱图（0．5mg/mL）
Spectralmapofsalicylicacid
Fig6
detectionlimit（0．5mg/mL）
·18·
中国兽药杂志2019年6月第53卷第6期ChineseJournalofVeterinaryDrug
2．3．5准确度和精密度试验取制得的阴性空白
溶液，分别加入适量的1mg/mL的水杨酸和乙酰甲喹标准溶液适量，制成高添加浓度样品（水杨酸20μg/mL，中添加浓度样品乙酰甲喹10μg/mL），（水杨酸10μg/mL，低添加浓乙酰甲喹5μg/mL），度样品（水杨酸2μg/mL，乙酰甲喹1μg/mL）。每
图7
乙酰甲喹的检出限光谱图（0．25mg/mL）Fig7
Spectralmapofdetectionlimit
个浓度三份平行样品。计算回收率以及相对标准偏差。结果显示水杨酸平均回收率为99．51%；乙酰甲喹平均回收率为99．62%；相对标准偏差ＲSD在0．07%～3．44%之间，结果见表2～表3。
ofacetoquine（0．25mg/mL）
表2
Tab2
添加终浓度/（μg·mL－1）
样品编号
1
恩诺沙星注射液中乙酰甲喹添加回收率实验结果
测定值/（μg·mL－1）
Experimentalresultsofrecoveryofacetoquineinenrofloxacininjection
回收率/%99．2599．1699．1699．19．3599．2399．7499．7599．33107．9499．19．28．7798．5399．28．2198．9098．96
98．77
0．37
100．87
3．44
99．22
0．07
平均回收率/%
ＲSD/%
9．929．929．929．929．949．924．994．994．975．404．9．960．990．990．990．980．990．99
102
3
1
52
3
1
12
3
表3
Tab3
添加终浓度/（μg·mL－1）
样品编号
1
恩诺沙星注射液中水杨酸添加回收率实验结果
测定值/（μg·mL－1）
Experimentalresultsofsalicylicacidadditionrecoveryrateinenrofloxacininjection
回收率/%100．1599．02100．1298．90100．19100．28
99．78
0．
平均回收率/%
ＲSD/%
20．0319．8020．0219．7820．0420．06
202
3
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·19·续表
添加终浓度/（μg·mL－1）
样品编号
1
测定值/（μg·mL－1）回收率/%100．72100．80100．83100．75100．54100．8497．1996．3398．9799．1598．97．49
平均回收率/%ＲSD/%
10．0710．0810．0810．0810．0510．081．941．931．981．981．981．95
102100．750．11
3
1
2298．001．19
3
2．3．6稳定性试验取同一阴性添加溶液，分别在值232nm作为定量波长时，乙酰甲喹也有较大吸收，以便获得最准确的吸收值，因此，选择232nm作为方法的吸收波长。3．3
光谱图的处理
作为定性的最主要图谱，对
阴性空白添加样品的光谱图中两个目标化合物进行峰纯度检查，当纯度角度小于纯度阈值时，判定为此出峰物质为单一物质，同时与标品光谱图比对出峰时间一致时，判定为此物质为对应出峰时间的标准物质添加，以此为添加物定性标准。
本方法采用二极管阵列检测器进行检测，实现了恩诺沙星注射液中添加乙酰甲喹、水杨酸的定性定量检测。同时可以通过峰纯度检查锁定非法添加物，通过保留时间与对照品进行对比，实现了恩诺沙星注射液中非法添加物的高效、快速、准确识别，成功建立了恩诺沙星注射液中添加乙酰甲喹、——高效液相色谱法。本方法乙酰水杨酸的测定—
甲喹检出限为0．25mg/mL、水杨酸检出限为0．5mg/mL。参考文献：
［1］中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典2015年版（一部）
［S］．
CommissionofChineseVeterinaryPharmacopoeia．Veterinary
0、2、4、8、12、24h进样10μL，记录色谱峰面积，乙酰甲喹、水杨酸峰面积的ＲSD均小于0．4%。结果表明供试品溶液在室温下放置24h稳定。2．3．7
耐用性
从柱温及色谱柱两个方面考察方
25、30、40℃，法的耐用性。改变柱温为20、出峰顺序无变化，保留时间稍有变化。使用不同品牌、不ThermpHypersiLGoLd（4．6×同型号的色谱柱，例如，250mm，5μm）；WatersXBridgeC18（4．6×150mm，5μm）；WatersXBridgeC18（3．5×150mm，5μm）等，结果3种成份仍能很好的分离且出峰时间理想。最佳实验条件的选择中流速的变化对3种成份的影响也不大，本方法的耐用性良好。33．1
讨论与结论流动相选择
《中国兽药典》2015版第一根据
部恩诺沙星注射液的含量测定方法，设定了流动相0．025moL/L磷酸溶液∶乙腈的比例，分别为83∶17，85∶15，90∶10，结果显示在流动相0．025moL/L磷酸溶液∶乙腈体积比为85∶15时，恩诺沙星、乙酰甲喹、水杨酸的分离度符合分离的要求，因此，选择0．025moL/L磷酸溶液∶乙腈（85∶15）为流动相。3．2
吸光度选择
由于在乙酰甲喹最大吸收值
时，水杨酸的的吸收度较低，在水杨酸的最大吸收
·20·
中国兽药杂志2019年6月第53卷第6期ChineseJournalofVeterinaryDrug
PharmacopoeiaofthePeople＇sＲepublicofChina（thefirstvolumeof2015edition）［S］．
［2］刘桂兰，夏雪林，仝玉慧，等．乙酰甲喹性质、毒性与替代药物
［J］．中国兽药杂志，2011，45（8）：46－49．
S］．［4］农业部．中华人民共和国农业部公告2508号［
MinistryofAgriculture．No．2508BulletinoftheMinistryofAgri-cultureofthePepole＇sＲepublicofChina［S］．
［5］李慧素，杜红鸽，吴宁鹏，等．HPLC－PDA法测定兽药中非法
LiuGL，XiaXL，TongYH，etal．Character，ToxinandSub-stitutionofMaquindox［J］．ChineseJournalofVeterinaryDrug，2011，45（8）：46－49．
［3］张志琴，司军强，呼海燕，等．水杨酸类药物的镇痛作用及其
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ZhangZhQ，SiJQ，HuHY，etal．ProgressofAnalgesicEffectandMechanismofSalicylates［J］．JournalofShiheziUniversity（NaturalScience），2003，7（4）：341－343．
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LiHS，DuHG，WuNP，etal．DeterminationofFourKindsofIllegalAdditivesAntipyretic－analgesicandAnti－inflammatoryDrugsinVeterinaryDrugsbyHPLC－PDA［J］．ChineseJournalofVeterinaryDrug，2014，48（10）：36－43．
（编辑：侯向辉）