3.云南农业大学动物医学院，云南昆明650200)摘要：对河南潔河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理，接种
到原代猪肺泡巨噬细胞中，经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株，命名为HeNLH2017株，并测定了该
分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点，扩增测定了 ORF5 基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示，该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30
毒株同源性最高，分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示，该分离株与我国2013年以来流行的
NADC30-like(Lineagel)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与
NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点，且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成
功分离到1株NADC30-like毒株.有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病
特点。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离鉴定；遗传进化分析中图分类号：S852.659.6
文献标识码：A 文章编号:1007-5038(2020)03-0036-04猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and Nspla、Nspl|3 以及 Nsp2 至 Nsp8 , pplab 可分解为
respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合
征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome
Nsp9到Nspl2⑷。根据其遗传背景的不同可以将
PRRSV分成美洲型和欧洲型2个基因型⑺。目前 在我国流行的主要为美洲型。virus, PRRSV)感染引起的猪传染病，主要造成妊娠母
猪流产、死胎.保育育肥猪的呼吸道疾病⑴。2006年，
PRRSV复制过程中基因组具有很高的变异率，
其中ORF5基因最容易产生变异，其编码的糖基化 囊膜蛋白GP5能够诱导机体产生特异性中和抗体，
我国江西省率先暴发了高致病性PRRSV(Highly
pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)，并迅速蔓延到我国 的各个地区，临床以高发病率和高致死率为特征，对
常用于研究PRRSV遗传变异情况™ ； Nsp2基因位
我国养猪业造成了巨大经济损失⑷。2013年以来，美 国NADC30毒株传入我国，并与我国流行PRRSV毒
于ORFla区域，是PRRSV基因组中变异最大的部 分⑷，在不同毒株之间差异比较大，当前至少存在
株发生了广泛的重组，衍生出许多NADC30-like毒
22种以上的氨基酸插入和缺失模式，如在HP-
PRRSV中存在约30个氨基酸的缺失，在NADC30-
株,在我国20多个省份地区广泛传播.给我国PRRS 防控带来新的难题®勺。猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病
like毒株中存在131个不连续的氨基酸缺失，这是
NADC30-like区别于其他毒株的重要标识之
毒，属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。基因组大小
-[1°o近年来PRRSV疫苗仍然以HP-PRRSV 毒株为亲本的弱毒苗为主，其无法针对NADC30- like毒株提供有效保护本研究从河南潔河地区 某养殖场提取PRRSV阳性病料，成功分离出1株
约为15.4 kb,不分节段，含有至少11个开放阅读框
(ORF)。PRRSV的相邻ORF间有重叠现象， ORF1编码与病毒复制相关酶的基因，是基因组中 最大的一段，占全长的80%,包括ORFla和
NADC30-like毒株，测定了该毒株的体外生长曲线，
并进一步对其ORF5基因和部分Nsp2序列进行了
ORFlb.分别编码ppla和pplab两种多聚蛋白， ppla经加工后可分解为9个非结构蛋白，分别为
遗传变异分析。收稿日期：2019-03-04基金项目：河南省农业科学院科研发展专项资金项目(2019CY01)；河南省生猪产业技术体系基金项目(S2012-06) 作者简介：阮海宇(1997-),男•河南信人.硕士研究生，主要从事诸病毒病诊斷技术及病原分子沆行病学研究。△同等贡献作者。*通讯作者阮海宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定371材料与方法1.1材料1.1.1病料来源2017年，河南潔河某猪场保育猪
群疑似发生PRRS疫情，发病猪群在14日龄左右免 疫了某厂家的TJM-F92弱毒疫苗，45日龄左右陆 续出现食欲减退，被毛粗糙，精神沉郁，扎堆.发烧，
咳喘，病死率达15%左右。取发病猪的肺组织送河 南省农业科学院动物免疫学重点实验室进行疫病诊
断。1.1.2 细胞原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveo
lar macrophages,PAM)、Marc-145 细胞、PRRSV N
蛋白单抗由河南省农业科学院动物免疫学重点实验 室提供。1.1.3 主要试剂与仪器 Trizol为Invitrogen公司
产品；DMEM培养基.RPMI 10培养基、胎牛血清
均为Solarbio公司产品；病毒核酸提取试剂盒为
Takara公司产品；胶回收试剂盒为美国Omega公 司产品；Q5超保真聚合酶为美国NEB公司产品；
pEASY- Blunt平末端连接载体、TransTl感受态细 胞为北京全式金公司产品；Cy3标记羊抗鼠二抗为
Abbkine 公司产品。梯度 PCR 仪(Mastercycler)为
Eppendorf公司产品；核酸电泳仪(JY600C)为北京 六一公司产品；凝胶自动成像系统(GENE GEN-
IUS)为GEN公司产品；高速冷冻离心机(3K-18)为 Sigma 公司产品；CO2 培养箱(Galaxy)为 Precision 公司产品；全自动倒置荧光显微镜(DMI-6000)为
Leica公司产品。1.1.4引物的设计与合成 ORF5引物、Nsp2引物
均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表
1)。其中Nsp2为鉴定引物，依据克隆片段长度大 小可以初步鉴定毒株分类。表1引物信息Table 1 Primer information引物名称 J3')片段大小/bp
Primer引物序列(5namePrimer sequence (5‘-*3‘)Product sizeNsp2-FGGAYACCTCCTTTGATTGG950( HP-Nsp2-RCTTGACAGGGAGCTGCTTGAPRRSV)/7(NADC30-like)ORF5-FTTTGGCAATGTGTCAGGCATORF5-RGAAAACGCCAAAAGCACCTT8501.2 方法
1.2.1病毒分离 取疑似阳性病料加1 mL预冷的PBS溶液研磨破碎后反复冻融3次，4 000 r/min离
心5 min。将上清通过0.22“m微孔滤膜过滤。按
照病料与培养基1 : 10的比例接种于PAM细胞 上，37°C孵育1 h后，更换为含有100 mL/L FBS的
培养基，于37°C培养箱培养3 d〜4 d后冻存于
—80°C。将上代病毒反复冻融3次，接种于下一代
PAM细胞。待到细胞出现明显病变，应用间接免疫
荧光检测(immunofluorescence assay,IFA),—抗为 鼠源PRRSV N蛋白单克隆抗体，二抗为Cy3标记
的羊抗鼠IgG,稀释1 000倍使用。1.2.2毒株鉴定收集病变细胞及培养液，按照病
毒核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA,使用
PrimeScript RT Master Mix进行反转录，得到病毒
cDNA。使用ORF5及Nsp2鉴定引物进行PCR扩 增，PCR 扩增程序为：98°C 30 s；98°C 10 s,58°C 10
s,72°C 30 s,30个循环；72°C 2 min。所得产物通过
10 g/L琼脂糖核酸电泳进行鉴定，通过胶回收试剂 盒对目的片段进行回收，将回收所得的目的片段连 接到pEASY-Blunt载体上，转化到TransTl感受态 细胞中。涂到含有氨节抗性的平板上，37°C过夜培
养，挑取单克隆进行菌液PCR筛选阳性克隆，选取 至少3个阳性克隆进行测序。1.2.3 病毒生长曲线绘制将病毒按照MOI值0.1 分别接种于PAM和Marc-145细胞中。取6、12、
24、36、48、72 h共6个时间点收取培养上清。按照
10倍梯度稀释后分别接种于培养PAM细胞和 Marc-145细胞的96孔板中。5 d后观察细胞病变 并按照Reed-Muench两氏法计算TCID50，并绘制病
毒生长曲线。1.2.4 序列遗传变异分析及进化树的构建用
DNAStar软件将测序获得的ORF5基因和Nsp2高
变区的序列与 CH-la、BJ-4、VR-2332、JXAl、JL580、
NADC30等经典毒株进行核酸及氨基酸的同源性分
析。系统进化树利用MEGA6.0软件按照邻接法进
行构建(表2),用Clustal W进行氨基酸序列比对
分析。2结果2.1病毒分离鉴定结果将病料接种PAM细胞盲传3代后，细胞开始 出现皱缩、破裂等明显病变，取连续传代至F8代病
毒接种PAM细胞48 h用N蛋白的单克隆抗体进
行IFA鉴定，结果显示，在PAM细胞上出现特异性 红色荧光(图1)。表明成功分离出1株PRRSV病
毒，命名为HeNLH2017株。通过RT-PCR鉴定(图
2),Nsp2目的片段约为7 bp,ORF5目的片段约 为850 bp,与预期相符。2.2病毒生长曲线与序列同源性分析HeNLH2017株在PAM细胞上生长曲线显示
38动物医学进展 2020年 第41卷 第3期（总第321期）病毒滴度在24 h最高，为105TCID50/mL（图3）。同 源性分析显示,HeNLH2017株ORF5基因和部分
基因核昔酸序列同源性为93.4%（氨基酸同源性为
93.1%）；部分Nsp2基因序列同源性为93.8% （氨基 酸同源性为.3%）（表3）。Nsp2序列与NADC30株相似性最高，其中ORF5
表2 PRRSV参考毒株信息Table 2 Information of PRRSV reference strains参考毒株
登陆号
来源参考毒株登陆号 来源Reference strainVR-2332CH-laBJ-4RespPRRS MLVJXA1NADC30CH-1RFJ1402HENXX-1HENXC-4Accession noAY1505.1AY032626.1AF331831.1AF066183.4EF112445.1JN654459.1EU807840.1KX169191.1KU950372.1KU950371.1OriginUSA, 1995China, 1996China, 2001USA, 2005China, 2007USA, 2008China »2008China,2014China»2014China,2015Reference strainJL580FJY0415SC315LN3HN07-1HN-HWFJWQ16SCN17SD17-38Accession noKR706343.1KP860910.1KX815428.1KX815425.1KX766378.1FJ797690.1KX758249.1MH078490.1MH068878.1OriginChina,2015China, 2015China,2015China,2015China,2016China, 2016China, 2016China* 2017China, 2017的氨基酸位点，分别为T3\\ N57和R104 （图5 ）。
HeNLH2017株Nsp2基因氨基酸序列缺失位置与
NADC30-like毒株相比基本一致。与BJ-4、VR-
2332等经典毒株相比总计有131个不连续的氨基 酸缺失，分别位于第322-432位、第483位和第504-
522位氨基酸（图6）,说明HeNLH2O17株具有
A.正常PAM细胞；B.PRRSV接毒48 h后的PAM细胞A.Normal PAM cells； B.PAM cells inoculated with PRRSV for 48 h图1 PAM病变及间接免疫荧光鉴定NADC30-like毒株特有的分子遗传标志。7 r2」 三墀・W0s
QnI」婆O>
H M 超
6 5 4 3 2 1
(LUIFig. 1 CPE in PAM cells and identification by indirect
immunofluorescence assayM 1
20 --------■-----■---------■--------1--------'--------10 12 24 36 48 60 72感染后时间/hTime post infection
图3 PRRSV分离株生长曲线
Fig.3 Growth curve of PRRSV strain
M.DNA 标准 DL 1 000； 1.ORF5 基因；2.Nsp2 基因M.DNA Marker DL 1 000； 1.ORF5 gene； 2.Nsp2 gene图2分离毒株鉴定结果3讨论研究表明，在PRRSV全基因组中ORF5和
Fig.2 Detected results of the isolated virusNsp2基因的变异程度最高，并且在一定程度上能反 映出全基因的变异趋势〔⑶。我国PRRSV流行情
况相对复杂，河南地区主要流行的PRRSV主要为
2.3 分子进化树分析利用MEGA6.0软件制作系统进化树（图4）。 结果显示,HeNLH2O17株与NADC30毒株处于同
HP-PRRSV和NADC30-like毒株，其他毒株在 临床上也偶有检出。NADC30-like毒株毒力和致死 率均低于高致病性毒株，但近年来在我国猪业生产
一进化分支。与近年来我国流行的HENXX-1、
HENXC-4 等 NADC30-like 毒株（Lineage 1）遗传 关系较近，与经典株如BJ-4、VR-2332和HP-
中持续传播并逐步成为优势流行毒株。本研究从河 南漂河地区临床PRRSV阳性病料中分离得到
PRRSV株如JXA1等遗传关系较远。HeNLH2O17毒株，并通过RT-PCR及IFA等方法
进行了鉴定。通过病毒生长曲线的绘制发现，HeN-
2.4氨基酸序列比对分析氨基酸序列比对结果显示，HeNLH2017株
LH2017株病毒滴度最高为105TCID50/mLo同时ORF5基因氨基酸序列有3个位点不同于其他毒株阮海宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30Jike毒株的分离鉴定39表3同源性分析Table 3Homology analysisCH-la/%BJ-4/%VR-2332/%JXA1/%JL580/%NADC30/%%GP587.0/86.686.0/85.686.1/85.185.0/85.693.1/90.693.4/93.1N/ANsp260.8/54.259.7/52.459.8/52.459.2/52.591.9/86.293.8/.3N/AAJiBFJY041------------------—NADC30FJ140215LN3-FJWQ16FJ1402
--------FJY04—•HeNLH2017-----儿 5 80—15SC3Lineage 1NADC30 HENXX-1 —Lineage 1100---------SD17-38FJWQ16
HENXC-4 15SC3 79-----------eHeNLH2017 HENXC-4100—SCN17 •15LN3—HENXX-1SCN17■几 580-------SD17-38 102^BJ-4rRespPRRSMLVLineage5limJRespPRRSMLV80rBJ-4
LVR-2332Lineage5VR-2332 91100H-1Rla~99.CH-1R CH-la97[-HN07-1Lineage9(-HN07-1 Lineage8^^HN-HWli-JXAl99ljJXAl 9PHN-HW0.050.05A.GP5基因系统进化树；B.Nsp2高变区序列系统进化树A.Phylogenetic tree of GP5 gene； B.Phylogenetic tree of highly variable region of Nsp2 gene
图4 基于ORF5基因和Nsp2基因高变区序列的系统进化树分析图5 ORF5基因氨基酸序列比对Fig. 5 Amino acid sequence alignment of GP5 geneJ22
432VL2332 DTSn»DVVLPGlAATQT】KLPgQCiALVl>WTQKSLCNN$\\'PLTAFSLANnYIAQCnEVMIE*LTAVLSILErWlMYGLaTEPCFRFTLPRGLDBLKX^EEDLLKLANAqTTSm&!A»AVBqVDLKTWVKNYPRinPPPPPPKVqPRKTKPVXSLPERKPYPA
OAI DT$n»NVVLPGVVAAJKJTTEqPBVNSCCrLVPP\\・TQEPLGnnVPLTAFSL3NCYYPAQGDEVHHXIRLNSYLSILEEVVUEYGUISTGLGPRPVLP5GLDEUaX^£IDLLKLANTQATSEIA!A»AAEQVDLKjWVKSYPRinPPPPPPRVQJ>RRTKSVKSLPEGU>VPA
DTSFWNVVLPGVEAANQnEQPHVNSCCTLVPPVIQEPLGD)SVPLTAFSLSNCYWA<}CaE^,HHHU.NSVLSE.EE\\VLEEYGLUSTGLCHLTVLPSGLDELK)QMEEDLLELANTQATSEJ4；AKAAEQ\\,DLKAWVISYPRHIPPPPFPRVQPRRTK8VKSLPEDrpvPA
OMR DT8FDiNWLPGVEAAMTTKqHVNQClALVPWT進 PLDKDSVPLT.4FSLSNCYTPAQGDEVRHKnLN8VUILEGVVLEEYGLM3TGLGnPVLS3GLDELK)QMEEDLLELANAQATSEIA!A*AAEQVDLK廣VKSYPRMPPPPPPRVe/KTKPVKSLPENIPVPA
CU-1. DT8n»NWLPGVEAAMTTKQLBVNQCTALVPWT(ffPLI：KDSVPLTAFSLSNCYTPAQCKVRBMtLNrVL8KLEGVVLEEYCLX8TGLGPRPVLPSGLDELKa^EWLLKLANAQATSEh3AAEQVDLKAJfVK$YPR5lTPPPPPPRTQPRKTKPVKSLPE>KPVPA
BJ4 DTFnWDWLPGtAATQTlKLPQVyQCtALVPVYTQKS+CNNSVPLTAFSLANnYlAQGlgVRHMRLTAVLSXLEKVVMEYGLETEPCMPTLPRGLDELKDgaenLLKLAHAQTTSmMWAVEQVCLKTWVKyiYPRyTPPPPPPinQPRKTKPVKSLPERKPVMI5LNJ DTSFMDAVLPGVGVTAQAAKLPP INQCHAPVTAVARLiPl SPELQSRKTGSVR$LPESKPLPAJL5M DTSFMDIVLPGVEVAACAVELPPTNQCBAPVTWAQG* SPEFQSRKAESVBSLFEN1PLPAIUOH20EJiADGO DTSFMDVVLPGVG\\AAQAAILPLINQCHAPVTV\\'TQISCTSnMDWLPGVG'AACVAELPLTyQCHAPTIIEAKG? LPEFQSBKAESV8SLPENBPLFA[sPEFQStKAESlRSLPENKPLPA413 50* 522W-2532 PiinGSCCGSPVttGaWNWEDLAVSSPFDLPTPPEPATPSSELVIVSSPQCiniPATPLSEPAPIPAPJtGTVSlPVTPI.SEFIPVPAPmFgqynU.SSAAAIPPYqDEPLDLSASSQTEYEASPPAPPQSGGVlGVBGHEAEETlSElSm'SGNlD'ASVSSSSSLSKAI PRIK\\lSDCCSPVliiGDNVPNCSE^-i!VGGPL)iFPTPSEPsn?VSEP\\lVJASUVPn.VrPLSGSAPVPAPJlITVT.....................................:..........7J.7.. JnLTHQDEPLI)LSASSQTEYEAFPLAPS(pa!CILEACGQEVEEVLSElSDlLNnWAPVSSISSLSHNOM PiJUniSCCGSPVUGD^NGSEB^GGPLNFPTPSEPOTtCEPVLVPASRIVPKLkTPLSCSAPVTAPRITVT.-^..^..^.-^..^..^-.^..^..^..JnLTBQDEPLDLSASSQTEYGV'FPLAPSDaiGILEAGGqEAEEVlSEISDILNDTNPAPVSSSSSLSCH-11 PRRKMSDCGSPlLMGDNVPNSlEDLnGGPLDFPTPSEPVrPLSEPVLfciPASQHlPRPmLSGPAPVPAPilTVSRPWTPLSEPIFVSAPRBKFQQVEEANPAAnLTYQDEPLDLSAFSQTEYEASPLAPLQNMGILEAGGQEAEEVLSGISDlLNDINPAPVSSSSSLS
CS-U PRtK\\'GSCCGSPIIl!GDNVl'NGKEDFAVG»LDF!'TPSEP^TPLSEP\\WASQHIPMnPLSGPAPVTAPWTVSWkTPLSEPIBSAPRHKFQQVEEANPMnLnQDEPLXSAFS(lTECEASPLAPLq»!GILEAGGQEAEEVLSGISDILNDINPAPVSSSSSLSBM PRtn'GSDCGSPVSLGGDVPNWEm.AysSProLPTPPELATPSSELVIVS»QCiniPATnSEPAPIPAPIC3TVSMnPLSEPIPV?APBMFQQV^ILSSAAAIPPYqjiEPLDLSASSQTEl'EASPPAPPQSGCVLGVIGmAEETLSEISI»：SGNIK>ASVSSSSSLS 15L» PUrrRSGCGMASLGGNFPCSREDiq-血FBSLVLPESVAl$NBP^7rr7T77777777严PAPRITVWLKLSSTnTPVPAPRCGLQQVEG0i3AVGALAttDELLDLSASSQTEYtASPLALPQSEGALAVRGKEAEEVUEAS@PDD【ILTPV$S$GSLS JL5I0 PRtRI«SS:CG8LVSLCGCFPDS»EDA4-<^PraSPVU.EPVAlSNEPM............................................Fl?APRITVraLKP$$VTJTPV?APRCiLQqVEQfl 发现该毒株在MARC-145上适应性不好，不能直接 6.6%和6.2%的遗传差异。从系统进化树观察, 用于病毒分离。HeNLH2017株 ORF5基因同其他流行的 HeNLH2017株虽然属于NADC30-like毒株， NADC30-like 株如 HENXX-1. FJWQ16 等同源性 40动物医学进展 2020年 第41卷 第3期(总第321期)较NADC30株更加接近。从氨基酸序列比对结果 来看，其GP5蛋白在30.57和104位具有特异性的 吸综合征病毒遗传进化分析[J].西南大学学报(自然科学版)， 2018,40(1):21-26.[6] 王雅兰.猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及DNA疫苗 的初步研究[D].北京：中国农业大学,2013.氨基酸位点，分别为T3\\N\"和衣\"，变异的氨基酸 位点是否会引起PRRSV毒株生物学特性的改变仍 [7] ZHOU L» YANG H.Porcine reproductive and respiratory syn 需要进一步研究确定。与经典毒株相比，变异毒株 的Nsp2基因均有着不同程度的缺失，如NADC30 [8] drome in China[J].Virus Res,2010,154( 1-2) :30-37.ZHANG L, FENG Y, MARTIN D P, et al. Genetic diversity and phylogenetic analysis of the ORF5 gene of PRRSV from 有着131个不连续的氨基酸缺失,JXA1有着90个 碱基的缺失，可以利用这一点鉴别PRRSV经典毒 株与变异毒株〔旧。HeNLH2017株Nsp2蛋白的氨 基酸序列NADC30-like毒株缺失序列位置基本一 central China[J].Res Vet Sci,2017,115：226.M杨汉春，周磊.猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化 [J].生命科学,2016,28(3):325-336.口0]郭振华，陈鑫鑫，李睿•等.中国猪繁殖与呼吸综合征病毒流 致，表明本次分离的HeNLH2017株归属于 行历史及现状[J].畜牧兽医学报,2018,49(1):1-9.NADC30-like 亚群。本文从临床PRRS病料中成功分离出1株 [11] 王林建，郭振华，乔松林，等.河南地区NADC30-like PRRSV 毒株的增殖特性与遗传进化分析[J].河南农业科学，2017,46 NADC30-like毒株，绘制了该毒株的体外生长曲线，并 进一步分析了其ORF5基因和部分Nsp2序列的遗传 (03):122-128.[12] BIAN T, SUN Y, HAO M, et al. A recombinant type 2 por cine reproductive and respiratory syndrome virus between 变异特点,为进一步研究该病的流行状况提供参考。 参考文献：[1] 郭敏.郎广平，冯娇，等.猪繁殖与呼吸综合征的研究进展 [J].中国畜牧兽医,2013,40(4):211-215.NADC30-like and a MLV-like： Genetic characterization and pathogenicity for piglets.[J].Infect Gen Evol»2017,54.[13] 郭天准，常洪涛，崔丹丹，等.2014-2015年河南地区PRRSV 的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析[J].病毒学报， [2] TIAN K, YU X.ZHAO T,et al. Emergence of fatal PRRSV variants： Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark C J 2• PLoS One, 2016(3)：298-307.[14] 周峰，常洪涛，赵军，等.2012-2013年猪繁殖与呼吸综 合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调査「J].中 国兽医学报,2014,34(9):1398-1404,1410.2007,2(6)：e526.[3] 杨汉春.2014年猪病流行情况与2015年流行趋势及防控对策 [15] WANG L J , WAN B,GUO 乙et al.Genomic analysis of a re combinant NADC30-like porcine reproductive and respiratory [J].猪业科学,2015(2):38-40.[4] 林思远，洪绍锋，黄加滨，等.PRRSV广西分离株GXYL-1403全 基因克隆与序列分析[J].动物医学进展，2016,37(2):44-49.syndrome virus in China[J].Virus Genes,2017. doi: 10.1007/ S11262-017-1516-1.[5] 周英顺，谢波，陈敏•等.2015-2016年川南地区猪繁殖与呼 Isolation and Identification of a Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus NADC30-like StrainRUAN Hai-yu1 ,GUO Zhen-hua2, LI Xiang3,QIAO Song-lin2 .ZHANG Gai-ping1'2(^.College of Animal Science and Veterinary Medicine , Henan Agricultural University ^Zhengzhou . Henan ,450002 tChina ；2. Henan Provincial Key Laboratory of Animal I mm unology , Hena n Academy of Agricultural Sciences , Zhengzhou , Henan ,450002 f China ；3.College of Veterinary Medicine ,Yunnan Agricultural University ^Kunming ^Yunnan ,650200,China )Abstract: A PRRSV strain was successfully isolated from clinical PRRSV-positive samples collected from Luohe, Henan province and named as HeNLH2017. The growth curve was determined on porcine alveolar macrophages (PAMs).To further analyze the genetic evolution,we amplified the nucleic acid sequences of the ORF5 gene and highly variable region of the Nsp2 gene.The homology analysis showed that the ORF5 gene and partial Nsp2 sequence had the highest homology with the NADC30 strain,which were 93.4% and 93.8% , respectively.Genetic phylogenetic tree analysis showed that the isolate was clustered into the same evolutionary branch with the NADC30-like (lineagel) strain that has been epidemic since 2013 in China.A- mino acid sequence alignment showed that the ORF5 gene and Nsp2 sequence have similar genetic variation characteristics to the NADC30-like strain, and the Nsp2 sequence has characteristic 131 discontinuous amino acids deletion.In brief,we successfully isolated a NADC30-like strain,which is helpful to further under stand the prevalence and clinical pathogenic characteristics of NADC30-like strain in Henan.Key words： Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;growth curve; phylogenetic analysis
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