HPLC分离技术

一、液相色谱分离条件选择

HPLC可供选择的固定相及流动相选择都有自身的特点和应用范围。选择分离类型应根据分离分析的目的、试样的性质和量的多少、现有设备条件等来确定最佳分离方法． 1、依据相对分子质量选择

一般的液相色谱(吸附、分配及离子交换)最适合的相对分子质量范围200—2000．对于相对分子质量大于2000的样品，则用空间排阻色谱较佳． 2、根据溶解性能选择

如果样品可溶于水并属于能离解的物质，以采用离子交换色谱为佳；如果样品溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液固吸附色谱；如果样品溶于四氯化碳，则大多数可采用常规的分配或吸附色谱分离；如果样品既溶于水，又溶于异丙醇，则可采用液—液分配色谱，以水和异丙醇的混合物为流动相，以憎水性化合物为固定相． 3、根据分子结构选择

判断样品存在什么官能团．然后确定合适的色谱分离类型．例如，样品为酸、碱化合物，则采用离子交换色谱；样品为脂肪族或芳香族，可采用液—液分配色谱或液—固吸附色谱；异构体采用液—固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的样品可用液—液分配色谱．现在将其

列入表18．10，作为选择分离类型的参考．

4、流动相的选择

a、液相色谱中流动相的一般要求

①化学稳定性好．与样品不发生化学反应；与固定相不发生不可逆作用，应保持色谱柱效或柱的保留性能长期不变． ②对样品组分具有合适的极性和良好的选择性．

③必须与检测器相适应，例如，采用紫外检测器，所选用的检测波长(工作波长)应比溶剂的紫外截止波长更长．所谓溶剂的紫外截止波长是当小于外截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量．表18．11列出了部分常用溶剂的紫外截止波长。

④高纯度，不纯的试剂会引起基线不稳定，或产生“伪峰”． ⑤低粘度，溶剂黏度过高，使压力增加，不利于分离；粘度过低，

容易产生气泡；常用低粘度溶剂有丙酮、乙腈、甲醇等．

B、液—固色谱的流动相

在液—固吸附色谱中，流动相称为洗脱剂．对极性大的组分采用极性强的洗脱剂；反之，采用极性弱的洗脱剂．

在实际工作中，溶剂的选择需通过实验来确定，合理配制二元溶剂，精细控制组分的K值，有可能使大多数样品组分实现良好分离．如

果组分的K值范围很宽，则应采取梯度洗脱． C、液—液色谱的流动相

在液—液分配色谱中，流动相与固定相的极性差异越大越好．正相分配色谱的流动相是以烃类(如己烷、庚烷等)为主，加入少量极性溶剂(如氯仿、甲醇等)改变流动相的极性和组成。反相分配色谱流动相是以水为主，再加入能与水混溶的有机溶剂，通过改变有机溶剂的组成，调整试样组分的容量因子，改善分离效率．甲醇是最常用的有机溶剂，其次是乙醇和四氢呋喃． D、键合相色谱

键合相色谱中固定相很稳定，不容易流失，适合于梯度洗脱．不同键合相色谱流动相的选择可参见表18．7．

在非极性键合相色谱中，若用水—甲醇、水—乙腈溶液为流动相，可分离极性物质；若用水和无机盐的缓冲溶液作流动相，可以分离易离解的物质，如有机酸、有机碱、酚类等．从而克服正相吸附色谱分离这些物质时的柱效低和容易产生拖尾峰等缺点． ·

在极性键合相色谱中，常在非极性或小极性溶剂(如烃类)中加入适量的极性溶剂(如氯仿、醇、乙腈等)为流动相，分离异构体、极性化合物等．

使用的流动相，和液固色谱、液液色谱使用的流动相有相似之处。 a、溶剂的选择性分组

常见溶剂的极性参数P’和选择性参数Xe、Xd和Xn。当将每种溶剂的三种Xe、Xd和Xn值组成一个三角形坐标时，选择性相似的溶剂分布在三角形平面中的一定区域内，从而构成选择性不同的溶剂分组。图4—6为溶剂选择性分组的三角形坐标图。表4—2列出了依据

溶剂选择性分组的各种有机化合物的类型。

由溶剂选择性分组的三角形坐标图可知，常用溶剂可分为8个选择性不同的特征组，处于同一组中的溶剂具有相似的特性。因此对某一指定的分离，若某种溶剂不能给出良好的分离选择性，就可用另一种其他组的溶剂来替代，从而可明显地改善分离选择性。

对甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醚、氯仿、二氯甲烷、水等常用溶剂，各处于第几选择性组，应有清晰的了解。

b、在键合相色谱中选择流动相的一般原则

在键合相色谱分析中常使用二元混合溶剂作为流动相，此时流动相的极性参数P’，可按下述实例进行计算。 二元混合溶剂的极性参数P为：

式中 P’a、Pb’——分别为溶剂A和溶剂B的极性参数， φa、φb％——分别为溶剂A和溶剂B在混合溶剂中所占的体积分数。

在正相键合相色谱中，流动相的主体成分为己烷(或庚烷)，为改善分离的选择性，常加入的优选溶剂为质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚(第1组)；质子给予体氯仿(第Ⅷ组)；偶极溶剂二氯甲烷(第V组)。 在反相键合相色谱中，流动相的主体成分为水。为改善分离的选择性，常加入的优选溶剂为质子接受体甲醇(第Ⅱ组)、质子给予体乙腈(第Ⅵb组)和偶极溶剂四氢呋喃(第Ⅲ组)。

表4—3和表4—4分别列出在正相色谱和反相色谱中使用的某些混合溶剂的特性，表达了当向己烷(或庚烷)、水中加入强洗脱溶剂后，引起溶质容量因子K’下降的倍数。

当使用二元混合溶剂时，在正相色谱的情况下，以正己烷(H)作为流动相主体，其PH’《1，它和极性溶剂A组成H／A混合流动相，若其Pmix’对给定的分离有合适的溶剂强度，即被分离溶质的k’在1～10之间。为改善分离的选择性，欲用另一极性溶剂B代替A，重

新组成H／B混合流动相，在保持极性参数Pmix’不变和已知A组分体积分数фA的条件下，．可按下述计算出将H／A改变为H／B时，所需B组分的体积分数фB。

由于PH’ 《1 ，可近似认为：

在反相色谱的情况下，水(W)作为流动相的主体，它与极性溶剂M组成W／M二元混合流动相，若其Pmix’给定的分离有合适的溶剂强度，即对样品组分有合适的K’值。为改善分离的选择性，欲用另一极性溶剂T代替M，重新组成W／T混合流动相，在保持Pmix’不变和已知M组分体积分数фm的条件下，也可计算所需T组分的体积分数фT。

13、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保留规律

图4—10表达了作为极性函数的样品和溶剂，在正相色谱和反相色谱中，选择不同极性溶剂作流动相时，引起不同极性溶质(A>B)的

保

留

值

变

化

的

一

般

规

律

。

在正相色谱(图4—10上半部)中，使用弱极性溶剂作流动相，则极性弱的B组分先流出，A组分后流出。当更换中等极性溶剂作流动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值都进一步减小。 在反相色谱(图4，10下半部)中，使用中等极性溶剂作流动相，则极性强的A组分先流出，B组分后流出；当更换强极性溶剂作流动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值会进一步增大。

E、离子交换色谱流动相

离子交换色谱流动相通常是盐类的缓冲溶液．通过改变流动相的pH、缓冲溶液的类型、离子强度、以及加入有机溶剂、配合剂都会改变分离选择性，提高分离效果．

流动相pH值大小控制酸碱离解平衡，从而控制了酸、碱组分的离子百分数．离子的比例越大，k值越大；反之，k值就小．若组分都以分子形式存在，则不被固定相保留．弱酸或弱碱的保留值取决于流动相的pH值．流动相的pH值是通过加入缓冲剂来． 对阴离子交换树脂，各种阴离子的保留能力次序为：柠檬酸根离子>SO4—>C2O4->I—>HS04—>N03->CrO4—>Br—>SCN—>C1—>甲酸盐>乙酸盐>OH—>F—．所以用柠檬酸根离子作流动相，各组分阴离子的保留值最小，反之，用氟离子作流动相，组分的保留值最大．

对阳离交换树脂，各种阳离子的保留能力顺序为：Fe3+ >Ba2+>pb2+>>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>CO2+>Zn2+>Mg2+>UO22+>Tl+>Ag+>C

s+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+加入配合剂，可以利用不同阳离子的配合常数差别，提高了分离的选择性．配合常数大的阳离子，由于以配合物或配合离子存在，以金属离子存在的比例减小，K值也随之减小．调节流动相的pH值或利用配位体缓冲溶液(金属离子的盐与其配合物配制的溶液)控制配位体浓度，从而可以控制阳离子以配合物存在的比例．充分利用配合剂的选择，提高分离效率． F、空间排阻色谱流动相

在空间排阻色谱中，流动相的选择不是为了提高色谱柱的选择性，而是为了使样品更好地溶解，或是为了减少流动相黏度，提高柱效．选用低黏度的流动相，其沸点要比柱温25—50℃，而且应与选用的固定相和检测器相匹配．例如，采用聚苯乙烯为固定相，不利用强极性溶剂(醇类、丙酮、二甲亚砜、水)为流动相．以硅胶为固定相，可选用的流动相很多．此时，利用水溶液为流动相，其pH值应控制2—8．5范围内。

二、分离操作条件优化的选择

进行高效液相色谱分析，选择适用的色谱柱，尽可能采用优化的分离操作条件，可使样品中的不同组分以最满意的分离度、最短的分析时间、最低的流动相消耗、最大的检测灵敏度获得完全的分离。 1、容量因子和死时间的测量

HPLC分析中，容量因子K’是一个非常重要的参数，它对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作

用。

容量因子可按下式计算：

2、样品组分保留值和容量因子的选择

希望完成—个简单样品的分析时间控制在10一30min之内，若为含多组分的复杂样品，分析时间可控制在60min以内。

若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间相对应的容量因子k’应保持在1—10之间，以求获得满意的分析结果。

对组成复杂、由具有宽范围k’值组分构成的混合物，仅用恒定组成流动相洗脱．在所希望的分析时间内，无法使所有组分都洗脱出来。此时需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分都在最佳状态下洗脱出来。当使用梯度洗脱时通常能将组分的k’值减小至原来的l／10一1／100，从而缩短了分析时间。

保留时间和容量因子是由色谱过程的热力学因素控制的，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。

在常规色谱条件下,如K’值过大,应增加溶剂的极性,在反相色

谱的情况下, K’值过大, 应降低溶剂的极性

正相溶剂序列: 水(极性最大)→乙腈→甲醇→异丙醇→四氢呋喃→乙酸乙酯→氯仿→苯→甲苯→正己烷

反相色谱中，水是弱溶剂，在甲醇/水为流动相的系统中增加

甲醇的比例，流动相变强。

反相色谱中，流动相中的有机溶剂增加10%，tR和K’值要减少

2-3倍。

3、相邻组分的选择性系数和分离度的选择

各种色谱分析方法的共同目的都是要以最低的时间消耗来获得混合物中各个组分的完全分离。在色谱分析中通常规定，当色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开时，其分离度R＝1．5。若分离度R＝1．0，表明两个相邻组分只分离开94％，可作为满足多组分优化分离的最低指标。

由影响分离度各种因素的计算公式：

可以看出分离度是受热力学因素[容量因子k’和选择性系数α(α=k2’／k1’)]和动力学因素(理论塔板数n)两个方面控制的。

表9-3 ，对给定k’＝3的组分，其与相邻组分的分离度

R＝1．0时，若它们的选择性系数α为不同值时所对应的理论塔板数”。

表9—4，对具有不同k’值的相邻组分，若它们的选择性系数α分别为1．05、1．10且使分离度R＝1．0时所对应的理论塔板数n。

若相邻组分的容量因子在1—10之间，R选择性系数保持大1：1．o 5—1．10以上，就比较容易达到满足多组分优化分离的最低分离度指标，即R＝1．0。

当选定一种高效液相色谱方法时，通常很难将各组分间的分离度都调至最佳，而只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持R＝1．0。若R＜1．0，仅呈半峰处分离，则应通过收变流动相组成或改变流动相流速，调节分离度尽可能使R＝1．0，这样才能满足淮确定量分析的要求。

对于两个浓度相等的组分，当Rs=1.5时，两个峰达到基线的完全分离，叫做6σ分离。若在两峰转折处分别收集两组分，被分离的两组分均可达到99．9%的纯度。若Rs=1这时两烽尖间的距离等于4，叫做σ分离，两峰只有3％的重叠，两组分的纯度都可达98％，回收率都是98%。不过，当两峰浓度不相等时，如第一个峰与第二个峰浓度之比为10：1，若Rs＝1．5，则组分l可全部回收，纯度为100％，而组分2只能回收99％，纯度为99．7％。若Rs=l，则组分2的回收率降到只有88％，纯度为98％。

对定性分析，Rs=0.8通常被认为是最低要求。对于浓度比为1 ：

1的两组分，回收纯度可达95％。

当谱图中出现相邻组分的重叠色谱峰时．不宜进行定量分析，若使用微处理机可计算出重叠组分各自的峰面积相含量，但不能提供准确可靠的分析结果。

对多组分的分离，不能笼统地说分离度如何，应当说明是指哪

一对峰的分离度。例如，象图2、25那样比较复杂的色谱图，如果所有的峰的分离都是重要的，则整个色谱分离的分离度取决于分离度最低值的两个峰。图2．25中的峰l与峰2的分离度有最低值(约为o．8)，就是这张色谱图的分离度。如果不是这张色谱图上所有的峰都重要，只是第4个峰是我们主要关心的组分，此时，就要看峰3与峰4及峰4与蜂5中哪个分离度较低，才能确定分离度。在图2·25中，确定峰3与峰4的分离度比峰4与峰5的要差些，故将峰3与峰4分离度的数值(一1．0)作为这张色谱图的分离度。 三、HPLC常遇问题

a、进行未知样品分析时经常遇到的另一个问题．是样品中的全部组分是否都从键中洗脱出来，是否还有强保留组分被色谱柱中的固定相吸留。

解决此类问题是比较困难的，通常对同一种样品可采用两种不同的高效液相色谱法进行分析。如可先采用硅胶吸附色谱法分析，若考虑有可能将强极性组分滞留；可再采用反相键合相色谱法分析．此时强极性组分会首先被洗脱出来，从而可判断强极性组分是否存在。对大部分未知样品来讲，至少应将两种完全的高效液相色谱方法配合使用．最后才能得到有关样品组成和含量的确切结论。

B、容量因子k’对分离的作用也是显而易见的。K’是溶质在固定相

和移动相中的分子数之比相中的分数

，故就是溶质分子在固定

。若k’＝0，组分在固定相中的分数为零，即

组分不被保留，组分的保留时间，tr＝tm,分离不能实现。当k’值增大

时，保留时间随之增加。不过，k’值足够大时，则项趋近于1；，

它对分离度的改善就不再起作用。相反的，由于k’的增大，保留时间亦随之延长，因峰的扩展作用而使检测困难。因此从分离度、分离时

间及对峰的检测出发，存在k’最佳值的范围，这时，最大值的范围。从表2．8，我们看出分离度R值随

变化的情况。

值处于

随 k’而变化的情况，即

当k’从小于1增加至5时，至l0以后，随精k’的增大，

值的增大很快。在k’值增大的增加较慢。当k’值超过10

之后，k’值增大对R’的影响就很小。因此，k’最佳范围应当是1＜k’＜10。在这个k’值范围，既可保证大的分离度亦可以使分离时间不至于过长，使峰的扩展不会太严重而对检测发生影响。

液相色谱分离对k’值的控制，通常是借助于选用溶剂强度不同的移动相来实现的。 选用强度强的溶剂作为移动相，溶质的k’值小，保留时间短；反之，选用强度弱的溶剂作为移动相，溶质的k’值大，保留时间长。因此，通过选用强度不同的移动相，可以控制组分的k’值。对一个初步分离，如果k’太小（k’＜1，应选用强度弱的移动相；若k’值太大，则应选用强度强的移动相。这样，通常选用溶剂强度不同的移动相，就可找到对分离台适的移动相强度，将k’值控制在最佳的范围即（1＜k’＜l0 ＝

四、 定性分析

定性分析就是要确定样品中的一些未知组分是什么物质。 色谱分析中的定性主要是依据特征性不是很强的保留值，这需要和已知的标准物质的保留值进行比对。由于即使保留值完全相同的两个峰，也可能是不同的物质，因此在最终准确确定色谱图中某个峰是什么物质时还需要一些辅助技术。

1、 利用保留值定性

利用保留值定性是最基本的定性方法，其基本依据是：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但是，相反的结论却不成立， 这就使得使用保留值定性时必须十分慎重。由于影响保留值的因素——色谱中的固定相和流动相在气相色谱和液相色谱中不完全相同，因此用保留值定性的方法在气相色谱和液相色谱中也不尽相同，下面就分别介绍气相色谱和液相色谱中用保留值定性的方法。

2、液相色谱中用保留值定性的方法

与气相色谱相比，液相色谱的分离机理就复杂多了，不仅仅是吸附和分配，还有离子交换、体积排除、亲核作用、疏水作用等。组分的保留行为也不仅只与固定相有关，还与流动相的种类及组成有关(气相色谱中组分的保留行为只与固定相种类和柱温有关，而与流动相种类无关)。因此液相色谱中影响保留值的因素比气相色谱中要多很多。 不能直接用保留指数(Kovats指数)定性。

在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值(tR’或VR’)与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。

在利用文献中的保留值数据进行比对和定性分析时要特别注意到：由于液相色谱柱的填柱技术较复杂，液相色谱所使用的色谱柱的重现性目前还很不理想，即使是同一批号的柱子，重现性也不一致，

这就使得使用文献上的保留值数据进行分析受到。文献报道的保留值数据只能作为定性分析的参考。可以根据这些数据和对样品的了解来选用已知标准物，再用这些已知标准物与未知物在同一色谱条件下直接进行对比。

最简单的保留值定性方法是将已知标准物质加到样品中去，若使某一峰增高，而且在改变色谱柱或洗脱液的组成后，仍能使这个峰增高，则可基本认定这个峰所代表的组分与已知标准物质为同一物质。

目前一些HPLC仪器配备了三维图谱检测器，如二极管阵列检测器，在进行未知组分与已知标准物质比对时，除了比较保留时间外，还可以比较两个峰的立体图形。如在使用二极管阵列检测器时，除了比较未知组分与已知标准物质的保留时间外，还可比较两者的紫外光谱图，如果保留时间一样，两者的紫外光谱图也完全一样，则可基本上认定两者是同一物质；若保留时间虽一样，但两者的紫外光谱图有较大差别，则两者不是同一物质。这种利用三维图谱比较对照的方法大大提高了保留值比较定性方法的准确性。

3、利用已知标准祥定性

利用标准样对未知化合物定性是最常用的定性方法。由于每一种化合物在一特定的色谱条件下(流动相组成：色谱往、枉温等不变)，有其特定的保留值，如果在相同的色谱条件下被测化合物与标祥的保留值一致，就可以初步认为被测化合物与标佯相同。如果多次改变流动相组成后，被测化合物的保留值均与标准样的保留值相一致，那么就能进一步证明被测化合物与标样相同。这就是使用标准样来鉴别未

知化合物的方法。

4、利用检测器的选择性定性

每种检测器均有其特殊性能。如示差折光检测器是一种通用性的检测器，但是灵敏度比较低。而紫外、荧光及电化学校测器则为选择性检测器，灵敏度比较高。所以如果将一定量的未知化合物进入柱后并联或串联着的这几种检测器(二种或二种以上)，视其响应情况可以初步判别此未知化合物为何类别。例如饱和烃及其衍生物在紫外光谱区(190一400nm)吸收很小；而以共轭双键结合的分子如芳香烃，在紫外区有吸收；分子中苯环愈多吸收愈强。所以如果将含有几个组分的混合物，同时注射入色谱柱，流出物同时进入并联的二种检测器，或按顺序依次进入串联的二种检测器，则可以通过所得的二张色谱图，由各组分在不同检测器上的相对蜂高而判别它们可能为何类化合物。就是二张由三组分同时进入并联的紫外和示差折光检测器后所得的色谱图。

比较图l1—l(a)和(b)，就能对这三个组分作一初步判断，峰1很可能是带有芳环的化合物，蜂2则不大可能带芳环，峰3则不能确定为何类化合物。总之，比较各组分在不同检测器上的相对响应值，有可能粗略地推测其结构或否定某种结构。

5、利用紫外检测器全波长扫描功能定性

在液相色谱中，使用最广泛的还是紫外检测器。

当色谱图上某组分的色谱峰顶出现时，即最高浓度谱带进入检测器时，停泵，然后对停在检测器中的组分进行全波长(180一80 0nm)扫描，得到该组分的紫外—可见光谱图，再取某一标准品按同样方法处理，也得一光谱图，比较这二张光诺图即能鉴别该组分是否与标准品相同。对于某些有特征紫外光谱图的化合物，也可以参看标准谱图来识别未知化合物。

当某一组分进入检测器后．有二束被选择的特定波长的光同时射到该组分分子上，在双笔记录仪上即能同时记录下该组分在这二个波长下的吸收率，即得到二张色谱因，如图11—2所示。

在固定的色谱条件下，每个化合物均有其特定的在不同波长下的吸收率比值，如当组分(1)进入检测器后可得到该组分在一组不同波长下的吸收率比值。例如：

其中A220nm表示该化合物在220nm下的吸收率，即色谱图的峰面积。当然对于组分(2)、 (3)，也有其不同波长下的特定的吸收率比值。取某些纯化合物在相同的色谱条件下作出不同波长下特定的吸收率比值，以组分(1)、 (2)、 (3)与纯化合物相比较，特有利于对组分(1)、 (2)、 (3)作出肯定或否定的定性结论。除此之外，比较色谱峰各点的吸收峰比值是否相同，可以鉴别色谱峰内是否夹杂另一种化合物，即检查峰的不纯度。

可定性的二极管阵列紫外检测器，它的主要特点是每一秒钟就能完成一次从200一800nm波长范围的扫描，并将扫描结果储入计算机，当样品从色谱柱出来，按高斯分布曲线的形式进入检测器时，每一秒

钟检测器都能对色谱峰上的点作一张全波长范围扫描的紫外光谱图，即获得有色谱信号、时间、波长的三维光谱图(图ll—3)。通过色谱图上各点的光谱图是

否相同可以来鉴别此蜂是否夹有杂质，井可以将它与标准品的紫外光谱团或标准谱图相比较以确认该未知物的结构。

5、利用改变流动相组成时被测组分保留值的变化规律定性 在反相系统中，不同类可解离化合物——有机酸类、有机碱类，在改变流动相PH值条件下，它们的保留值变化有其独特的规律，如图1I—4所示。有机酸类的k’值(容量因子) 随流动相的PH—PKa值的减小而增加(图中实线)。对于某一种有机酸其解离常数PKa为一常数，所以也就是说，随着流动相中PH值的减小，k’值逐渐增加，这是由

于流动相中增加氢离子浓度后，抑制了有机酸的解离所致。而有机碱类的k’，随流动相的pH—PKa值的增加而增加(图上虚线)。也就是说随着流动相中PH值增加，k’逐渐增加，这是由于流动相中增加氢离子浓度后，抑制了有机碱的解离所致。

因此，对于一个未知化合物来说，测得其随流动相PH值变化后的k’变化规律，即能判断其为有机酸类或有机碱类。

五、定量分析

色谱中常用的定量方法有归一化法、标准曲线法、内标法和标准法。按测量参数分，又可将上述四种定量方法分为峰面积法和峰高法。这些定量方法又各有优缺点和使用范围，在什么情况下，选用哪种定量方法，十分重要。如果定量法选择的不合适，所得出的定量结果也必然有较大的误差。

1、峰高法和峰面积法的选择

在色谱定量分析中，选用峰高法还是选用峰面积法，主要决定在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性和重复性。

归一法最好用峰面积法外，其他三种定量方法中峰高和峰面积都可用精确的定量方法。

在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度影响，要准确地测量峰高和峰面积，色谱分离应达到一定的分离度才行。

由表3—13数据可看出：当流动相(GC的载气，HPLC的洗脱液)流速可以准确控制，而影响容量因子(k’)的一些因素(如GC的柱温、HPLC的流动相的组成)不能保持恒定(如使用GC的程序升温，HPLC的梯度洗脱)时，用峰面积定量较好；

而当容量因子(k’)和柱效(n)保持不变，流动相流速不稳定，有微小变化时，峰高受到的影响要小于峰面积，此时用峰高定量能得到较为精确的定量结果。

总之，在分离度较好，色谱峰形较好，峰面积可以准确测量时，用峰面积法定量为好。特别是在气相色谱使用程序升温和液相色谱使用多元梯度洗脱时，最好使用峰面积法定量。但当分离度不好，色谱峰形不好(如严重拖尾)时，峰面积测量引起的误差较大，此时使用峰高法定量较好。

保留时间短的色谱峰峰形较尖(峰尾宽较小)，此时峰高测定较峰面积测定准确，宜用峰高法定量；而保留时间长的色谱峰峰形较宽(峰尾宽较大)，此时峰面积测定较峰高测定准确，宜用峰面积法定量。

2、归一化法

把所有出峰的组分含量之和按100％计的定量方法，称为归一化法。当样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都能产生信

号的样品，可用归一化法定量，其中组分i的质量分数可按式(3—18)计算：

式中 Ai---组分i的峰面积；fi’——i组分的质量校正因子。

当fi’为摩尔校正因子或体积校正因子时，所得结果分别为i组分的摩尔百分含量或体积百分数。

归一化法的优点是简便、准确，特别是进样量不容易准确控制时，进样量的变化对定量结果的影响很小。其他操作条件，如流速、柱等变化对定量结果的影响也很小。

归一化法定量的主要问题是校正因子的测定较为麻烦， 归一化法主要用于GC的定量测定

对于HPLC，由于经常使用的一些检测器(如UV，荧光等)，不仅对不同组分的响应值差别较大，不能忽略校正因子的影响，而且对于某些组分可能没有响应值(即不出峰)，因此在HPLC中很少使用归一化法定量。

3、标准曲线法

标准曲线法也称为外标法或直接比较法，这是在色谱定量分析中，特别是HPLC定量分析中比较常用的方法，是一种简便、快速的绝

对定量方法(归一化法则是相对定量方法)。

首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。

在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准工作曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰的峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度，也可通过式(3—19)计算这一浓度。

式中 Ai(h1)—— i组分峰的峰面积(峰高)，。fi--i组分标准工作曲线的斜率。

知道进入色谱柱中样品组分的浓度后，就可根据样品处理条件及进样量来计算原样品中该组分的含量了。

当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正法，即直接比较法定量。先配制一个和待测组分含量相近的已知浓度的标准溶液，在相同的色谱条件下，分别将待测样品溶液和标准样品溶液等体积进样，作出色谱图，测量待测组分和标准样品的峰面积或峰高，然后由式(3—20)直

接计算样品溶液中待测组分的含量：

式中 Ws----标准样品溶液质量分数，％； Wi--样品溶液中待测组分质量分数，％； As(hs)——标准样品的峰面积(峰高)； Ai（hi）——样品中i组分的峰面积(峰高)。

单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统误差时(即标准工作曲线不通过原点)，单点校正法的误差较大。

标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了，计算时可直接从标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间，在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正，以确定该标准工作曲线是否还可使用。

标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件(检测器的响应性能，柱温度，流动相流速及组成，进榉量，柱效等)很难完全相同，因此容易出现较大误差。另外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品(或已知准确含量的样品)，因此对样品前处理过程中欲测组分的变化无法进行补偿。

4、内标法

选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定量加到样品中去，

依据欲测组分和参比物在检测器上的响应值(峰面积或峰高)之比和参比物加入的量进行定量分析的方法称为内标法。它克服了标准曲线法中，每次样品分析时色谱条件很难完全相同而引起的定量误差。

内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质，该物质的性质应尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰，或位于几个欲测组分的峰中间，但必须与样品中的所有峰不重叠，即完全分开。内标物的加入量应与欲测组分相近。当欲测组分（i）的量为wi；，加入内标物(s)的量为ws。，待测组分(I)和内标物（s）的峰面积(或峰高)分别Ai(或hi)和As(或hs)，待测组分（i）和内标物(s)的质量绝对校正因子分别为fi和fs，

wi＝fi’Ai（hi） ws＝fs’As（hs）

式中fi’为待测组分(I)对内标物(s)的质量相对校正因子，可

由实验测定或由文献值进行计算得到。 。

为使内标法适用于大量样品分析，可对内标法作一改进，将内标法与标准曲线法相结合，即使用内标标准曲线法。方法如下：用欲测物质配成一系列不同浓度的标准溶液。取相同体积的不同浓度标准溶液，分别加入同样量的内标物，然后在相同的色谱条件下分别加入内标的一系列标准溶液。以欲测组分与内标物的响应值之比Ai（hi）/ As（hs）为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，得到一条内标标准工作曲线此直线应通过原点(如不通过原点，则说明方法有系统误差)