腺相关病毒介导的小鼠prnp基因打靶载体构建

维普资讯 http://www.cqvip.com 江西农业学报２００８，２０（５）：７８～８１　Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｅ　Ｊｉａｎｇｘｉ　腺相关病毒介导的小鼠ｐｒｎｐ基因打靶载体构建　王海鹰　，万家余　，聂代邦２，高宏伟　（１．军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春１３００６２；２．吉林大学和平校区畜牧兽医学院，吉林长春１３００６２）　摘要：利用三重融合ＰＣＲ方法构建了小鼠ｐｒｎｐ基因敲除载体。提取１２９小鼠基因组，设计引物扩增打靶载体同源臂，　把两同源臂与ｎｅｏ基因三元件ＰＣＲ扩增成一条融合基因。融合基因与从Ｖ载体酶切后的载体骨架通过Ⅳ０ｔ，酶切位点相连　接，构建重组质粒载体ｒ从Ｖ。　关键词：ｐｒｎｐ；基因敲除；腺相关病毒载体；融合ＰＣＲ　中图分类号：Ｑ７８２文献标识码：Ａ文章编号：１００１—８５８１（２００８）０５－（ＫＹ／８—０４　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｄｅｎｏ——ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｍｏｕｓｅ　ｐｒｎｐ　Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＷＡＮＧ　Ｈａｉ—ｙｉｎｇＩ１　，ＷＡＮ　Ｊｉａ—ｙｕ　，ＮＩＥ　Ｄａｉ—ｂａｎ　，ＧＡＯ　Ｈｏｎｇ—ｗｅｉ　‘　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００６２，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｆ　ｏＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００６２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｄｅｎｏ——ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｍｏｕｓｅ　ｐｒｎｐ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｏｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ——ｗａｙ　ｆｕｓｉｏｎ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ．１２９　ｍｏｕｓｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｏｒ　ａｍｐｌｉｆｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｄｏｇｙ　ａＩ１ＩＩｓ　Ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　＆ｒｕ１．ｒｉｇｈｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎｎ　ａｎｄ　ｎｅＤ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｆｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｎｅ　ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｒＡＡＶ　Ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｌｉｇａｔｉｎｇｆｕ－　ｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎｔｏ　ｖｅｃｔｏｒ　ｂａｃｋｂｏｎｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｎｏｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｉｔｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｒｎｐ：Ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ：Ａｄｅｎｏ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ；Ｆｕｓｉｏｎ　ＰＣＲ　朊蛋白（ｐｒｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）是动物传染性海绵状脑病的　致病蛋白，是由朊蛋白基因（ｐｒｎｐ）编码的一种糖蛋白。　打靶载体，并在实验中取得了可喜的结果，在人的成纤维　细胞中打靶频率高达ｌ％　，比普通载体的打靶效率高　牛的传染性海绵状脑病（ＢＳＥ）俗称疯牛病，是一种严重　危害人类健康和世界经济发展的传染性疾病。疯牛病　１９８６年首次在英国发现，随后大面积暴发，研究疯牛病　的致病机理及检测方法一直是生命科学界所研究的　热点。　出４～５个数量级。鉴于这一优点，本实验采用ＡＡＶ做　打靶载体，探讨了构建效率高的鼠的ｐｒｏｐ基因敲除　载体。　１材料与方法　１．１实验载体和菌株打靶载体ＡＡＶ　ｈｅｌｐｅｒ—ｆｒｅｅ　ｓｙｓ—　ｔｅｍ购自ｓｒａｔａｇｅｎｅ公司。克隆载体ｐＭＤ一１８Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ购　因为ｐｒｎｐ基因在哺乳动物中具有高度的同源性，所　以以小鼠为研究朊蛋白病的动物模型具有可行性。小鼠　的ｐｒｎｐ基因是位于２号染色体的单拷贝基因，全长　３８４１８　ｂｐ，含有３个外显子和２个内含子，编码框在外显　自Ｔａｋａｒａ生物技术公司。实验菌株ＤＩ－Ｉ５为实验室保存。　１．２主要实验试剂各种性内切酶、Ｔａｑ酶、Ｔ　４连　接酶、碱性磷酸酶，购自ＴａＫａＲａ生物技术公司；ＤＮＡ凝　胶片段回收试剂盒购自杭州维特洁生物技术公司；质粒　子３上。ｐｒｎｐ基因表达非常广泛，在神经系统、淋巴组　织以及肝脏、肺脏、肾脏、肌肉中都有不同程度的表达，　ＤＮＡ小量提取试剂盒购自博日生物技术公司。　１．３引物设计及合成　但以中枢神经系统表达最高。　基因敲除又称基因打靶（ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）技术，是通　过外源ＤＮＡ与染色体ＤＮＡ之间的同源重组，精细地定　１．３．１　５　同源臂扩增引物（模板序列ＧｅｎＢａｎｋ登录号　Ｕ２９１８６）ｐｒｐ５Ｆ：（２１　ｂｐ）５　一ＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＣＴＩ　ＧＣ—　ＣＴＣＴ一３　；ｐｒｐ５Ｒ：（２１　ｂｐ）５　一ＧＡＴＡＴＩ＇ＧＣＡＴＧＧＴｒＧＴ－　点修饰和改造基因ＤＮＡ片段的技术。它是在胚胎干细　胞技术和同源重组技术的基础上发展起来的，１９８７年第　—ＴＡＣＧＣ一３　；扩增产物为１１３１　ｂｐ。　１．３．２　３　同源臂扩增引物（模板序列ＧｅｎＢａｎｋ登录号　Ｕ２９１８６）ｐｒｐ３Ｆ：（２２　ｂｐ）５　一ＴＧＣＴｒＧＴｒＣＣＴｒＣＧＣＡＴ－　ＴＣＴＣＧ一３　；ｐｒｐ３Ｒ：（２４　ｂｐ）５　一ＣＧＣＣＡＧＧＴＧＴｒＣＡＴ－　个基因敲除小鼠诞生。本实验是用腺相关病毒载体　（ＡＡＶ）做为打靶载体的，ＡＡＶ是单链ＤＮＡ的细小病毒　组，长４．７　ｋｂ，作为依赖病毒属的亚科的成员，ＡＡＶ依赖　其他病毒如腺病毒和单纯疱疹病毒来完成它的生命周　期。ＡＡＶ多用于基因治疗载体，１９９８年首次被用于基因　收稿日期：２００８—０２－２８　ＣＡＴＡＧＣＴｒＣＴ一３　；扩增产物为１２３２　ｂｐ。　１．３．３　ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ＣＤＳ序列扩增引物ＰＧＫ　ｎｅｏ　Ｆ：（５Ｏ　作者简介：王海鹰（１９８２一），女，内蒙古呼伦贝尔人，博士研究生，从事转基因动物及基因打靶方面的研究。　通讯作者：高宏伟。　维普资讯 http://www.cqvip.com

５期　王海鹰等：腺相关病毒介导的小鼠ｐｒｎｐ基因打靶载体构建　７９　ｂｐ）５　一ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴ—　ＴＣＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴ一３　：ＰＧＫ　ｎｅｏ　Ｒ：（４９　ＧＡＴＣＣｂｐ）５　一ＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡ————－１．４．５融合基因扩增融合片段ｐｒ５　扩增：以１００倍　０稀释ｐｒｐ５质粒为模板，ＰＣＲ反应体系为５０　，组分为：　——　模板２．５　Ｌ、上下游引物（１０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ）各２．５　、１０　ｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ、１０　ｒｅｏｔｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　、Ｅｘ　Ｔａｑ酶１　，ＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴ－３　，画线部分表示与３　同源　臂重叠序列。　１．３．４融合基因扩增引物内切酶识别位点ｂｐ）５　一　ＰｒＰ５Ｆ：（３０　ＴＣＡＣＴＧＴｒＧＴＣＣＴｒＡＧＣＣＴＣＴＧ一３　，　补水至终体积５０　；反应条件为：９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ．４６℃退火３０　ｓ．７２℃延伸１　ｍｉｎ，　共３０个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物回收（命名　画线部分表示ＮｏｔＩ性；ＰｒＰＳＲ：（５０　ｂｐ）５　一　为ｐｒ５　）。融合片段ｐｒｏ０３　扩增：以１００倍稀释ｐｒｐ３质粒　ＡＡＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＡＣＣＣＧＧＴＡＧＡ　ＡＴＧＡＴＡＴＩ＇ＧＣＡＴＧＧ—　ＴＴＧＴＴＡＣＧＣＣＡＴ一３　；ＰｒＩ】３Ｆ：（５０　ｂｐ）５　一ＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴ－　ＴＡＴＣＡＴＧＴＣｒＧＧＡＴＣ　ＧＩ朗［ＴＧ兀℃ＣＩＴａ。Ｃ　ＡＴＩ℃ＴＣＧＴＧ　一　３　，画线部分表示与ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ＣＤＳ重叠序列；ＰｒＰ３Ｒ：（３２　ｂｐ）５　一　ｃＧＣＣＡＧＧＴＧＴｒＣＡＴｃＡＴＡＧｃＴＩ℃一３　，　画线部分表示ＮｏｔＩ酶切位点。所有引物均由上海生物工　程公司合成。　１．４实验方法　１．４．１小鼠组织基因纽提取　小鼠肝脏组织基因组采用杭　州维特洁生化技术有限公司Ａｎｉｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｍｉｎｉ—ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ提取。提取的ＤＮＡ于一２０℃保存备用，用　１％的琼脂糖凝胶电泳对提取的基因组ＤＮＡ进行鉴定。　１．４．２　３　同源臂的ＰＣＲ扩增及克隆　３　同源臂的ＰＣＲ　扩增以１００　ｎｇ小鼠肝脏细胞的基因组为模板，ＰＣＲ反应　体系为５０　，组分为：模板１００　ｎｇ、上下游引物（１０　ｐ，ｒｎｏｌ／Ｌ）各２．５　、１０　ｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ反应ｂｕｆｆｅｒ　５　、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　ｉｘＬ，Ｅｘ　Ｔａｑ酶１　，补水至终体积５０　ｉｘＬ；反应条件为：９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ、５３　℃退火３０　ｓ．７２℃延伸１　ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃延伸　１０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物回收（命名为ｐｒｐ３），连接到ｐＭＤ一　１８Ｔ载体上。　１．４．３　５　同源臂的ＰＣＲ扩增及克隆　５　同源臂的ＰＣＲ　扩增以１００　ｎｇ小鼠肝脏细胞的基因组为模板，ＰＣＲ反应　体系为５０　，组分为：模板１００　ｎｇ、上下游引物（１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）各２．５　、１０　ｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ反应ｂｕｆｅｒ　５　、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　Ｌ、Ｅｘ　Ｔａｑ酶１　Ｌ，补水至终体积５０　；反应条件为：９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ．４８　℃退火３０　ｓ，７２℃延伸１　ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃延伸　１０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物回收（命名为ｐｒｐ５），连接到ｐＭＤ一　１８Ｔ载体上。　１．４．４　ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ＣＤＳ及其启动子ＰＧＫ，ｐｏｌｙＡ扩增以　１　质粒ＰＧＫｎｅｏｔｐＡｌｏｘ２为模板，ＰＣＲ反应体系为５０　，组分为：模板１　、上下游引物（１０　ｐ，ｒｎｏｌ／Ｌ）各２．５　、１０　ｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ反应ｂｕｆｅｒ　５　、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　、Ｅｘ　Ｔａｑ酶１　Ｉ．ＬＬ，补水至终体积５ｏ　；反应条件为：　９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ，６３℃退火３０　ｓ，７２　℃延伸９０　ｓ，共３０个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。用１％的　琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ产物进行鉴定（命名为ＰＧＫ—　ｎｅｏ—ＰＡ）。　’　为模板，ＰＣＲ反应体系为５０　，组分为：模板２．５　、　上下游引物（１０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ）各２．５　Ｉ山Ｌ、１０　ｘＥｘ　Ｔａｑ　ｂｕｆｅｒ　５　Ｌ、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　Ｌ、ＥｘＴａｑ酶１　ＩＬＬ，补水至终体　积５０　；反应条件为：９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ．４８℃退火３０　ｓ、７２℃延伸１　ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃　延伸１０　ｍｉｎ，ＰＣＲ产物回收（命名为ｐｒｐ３　）。融合基因扩　增：以ｐｒｐ５　、ｐｒｐ３　、ＰＧＫ—ｎｅｏ—ＰＡ三个ＰＣＲ产物为模　板。ＰＣＲ反应体系为５０　，组分为：模板各为１　、　ＰｒＰ５　ｕｐ引物和ＰｒＰ３　ｄｏｗｎ引物（１０　ｐ，ｒｎｏｌ／Ｌ）各２．５　、　１０　ｘＥｘ　Ｔａｑ　ｂｕｆｅｒ　５　Ｌ、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５　Ｉ．ＬＬ、Ｅｘ　Ｔａｑ　酶１　Ｉ．ＬＬ，补水至终体积５０　；反应条件为：９４℃预变　性２　ｍｉｎ；９４℃变性３０　ｓ、５６℃退火３０　ｓ、６８℃延伸４　ｍｉｎ，共２０个循环；６８℃延伸５　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物回收（命　名为融合基因），连接到ｐＭＤ一１８Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ载体上。　１．４．６融合基因与打靶栽体的连接将测序正确的融　合基因质粒进行Ⅳ０　酶切，酶切体系为ＮｏｔＩ　２　、Ｏ　ｘ　Ｂｕｆｅｒ　６　Ｌ、质粒２０　，补水至终体积６０　Ｌ；反应条件：　３７℃，３．５　ｈ，将酶切产物进行凝胶回收（命名为ｐ５一ｎｅｏ　—ｐ３）。将ＡＡＶ　ｈｅｌｐｅｒ—ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ中的ｐＡＡＶ—ＭＣＳ　进行Ⅳ０　酶切，酶切体系及反应条件同上，将酶切产物　进行凝胶回收（命名为ＡＡＶ—ＩＴＲ）。将凝胶回收产物　ＡＡＶ—ＩＴＲ进行去磷酸化，反应体系：ＡＡＶ—ＩＴＲ　１０　、　ＣＩＡＰ酶１　、ＣＩＡＰ　ｂｕｆｅｒ　２　，补水至终体积２０　；　反应条件为：３７℃１５　ｍｉｎ、５０℃１５　ｍｉｎ、６５℃３０　ｍｉｎ。　将ＡＡＶ—ＩＴＲ去磷酸化产物与ｐ５一ｎｅｏ—ｐ３进行连接反　应，反应体系：ＡＡＶ—ＩＴＲ去磷酸化产物１　、ｐ５一ｎｅｏ—　ｐ３　５　、Ｔ４连接酶０．５　、Ｔ４连接酶ｂｕｆｅｒ　１　Ｌ，补水　至终体积１０　ｉｘＬ；反应条件：１６℃１６　ｈ（命名为ｒＡＡＶ）。　１．４．７基因操作ＰＣＲ产物回收、连接反应、细菌转化、　质粒提取、酶切鉴定等技术参照相关试剂盒说明书进行。　１．４．８测序反应由上海捷瑞生物技术公司完成。　２结果与分析　２．１　３　同源臂的构建　和　，删酶切、测序鉴定　３　同源臂，其插入正确，克隆为ｐＭＤ一１８Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ，质粒大　小为３．４　ｋｂ（图１）。　２．２　５　同源臂的构建ＳａｌＩ和ＢａｍＨＩ酶切、测序鉴定５　同源臂，其插入正确，克隆为ｐＭＤ一１８Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ；质粒大　小为３．３　ｋｂ（图２）。　２．３融合基因的构建测序鉴定融合基因，其正确插人　维普资讯 http://www.cqvip.com ８０　江西农业学报　２０卷　到ｐＭＤ一１８Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ载体上，质粒大小为７．４　ｋｂ（图３）。　ＤＨ５ａ，提质粒，ＮｏｔＩ酶切，测序鉴定，质粒大小为７．７　ｋｂ　（图４）。　２．４融合基因与打靶载体的连接连接产物进行转化　ｓ０ＯＯｂｂ——｛　勰＝穹：　——‘　—一３４００ｂｐ　—《一３３０ＯｂＤ　２５００ｂｐ　—．ｊ—　ｌＯ００ｂｐ　—　－　ｌＯ００ｂｐ　２５０ｂｐ　１：１５０００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２：ｐｒｐ３／ＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩ；３：ｐｒｐ３　ｐｌａｓｍｉｄ。　１：１５０００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｘｋｅｒ；２：ｐｒｐ５／ＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩ；３：ｐｒｐ５　ｐｌａｓｍｉｄｏ　图１　３　同源臂的鉴定　图２　５　同源臂的鉴定　５０００ｂｐ‘——　溉＝李　—・∈一７４００ｂｐ　２５００ｂＤ　勰～　妻一脚　１：１５０００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２：０５一ｎｅｏ—ｐ３一Ｔ。　１：１５０００　ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２：ｒＡＡＶ；３：ｒＡＡＶ／Ｎｏｔｌ　图３融合基因的鉴定　图４　ｒＡＡＶ鉴定　年，Ｂｕｅｌｅｒ等首先利用基因打靶技术获得了ｐｒｎｐ－／一的　小鼠　Ｊ，并且发现这些小鼠没有明显的发育和表型异常。　随后，Ｂｕｄｅｒ等、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ等、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ等的研究表明，这　种ｐｒｎｐ基因敲除或者缺失的小鼠都对Ｐｒｉｏｎ疾病的发生　具有抗性。虽然国外已经建立ｐｒｎｐ一／一小鼠模型技术　Ｐｒｐ：￣ｄｏｒｙｎｐｒｉｍｅｒ　——／　Ｐｒｐ５　ｐｒｉｍｅｒ　＋　路线，但本实验采用ＡＡＶ这个新型的打靶载体来进行基　因敲除载体的建立，将会进一步提高打靶效率，同时也为　研究ＡＡＶ载体的功能提供了很好的实验思路。　本实验采用了新型的打靶方式，即以线性的、单链　ＤＮＡ的ＡＡＶ载体为打靶载体。ＡＡＶ打靶载体包含３～　４　ｋｂ的染色体打靶位点基因组ＤＮＡ，此位点在ＡＡＶ的　两个顺式作用元件ＩＴＲ之间。ＡＡＶ载体能引起大量不　图５三重融合ＰＣＲ图解　３讨论　随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展，人们对　动物疫病的控制和预防越来越倾向于转基因技术。近年　来，疯牛病在欧洲和美国暴发与蔓延，它是宿主自体朊蛋　白的一种构象病，不能进行免疫识别，而对该病的发病机　同的突变进入单拷贝染色体位点，包括小片段的插入（２０　ｂｐ）缺失，替换同时还有大的选择标记的插入（１～１．５　ｌｄ））。ＡＡＶ介导的基因打靶具有高效性、高保真　］、可　理的研究仍待深入，目前人们对该病的防治仅限于防，而　不能治，因此，转基因动物的培育，将会给此类疫病的防　治带来福音　。　以作用于多种细胞，并且没有细胞毒性等优点。　本实验采用的是三重融合ＰＣＲ的方法　（图５），即分　别扩增打靶载体的同源左臂、同源右臂、Ｎｅｏ基因，再设计　３对嵌合引物使３个基因片段有重叠区，然后将纯化的３　个ＤＮＡ片段放在同—个反应里进行后续的ＰＣＲ步骤，利　用嵌合引物之间的重叠序列将３个片段融合在一起，得到　ｐｒｏｐ基因敲除小鼠动物模型的建立，对研究疯牛病的　的作用，尤其是用此动物模　型做抗ｐｒｐ单抗对活体检测疯牛病有深远的意义。１９９２　维普资讯 http://www.cqvip.com ５期　王海鹰等：腺相关病毒介导的小鼠ｐｒｎｐ基因打靶载体构建　ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．，２００２，２０：７３５－７３８．　８１　融合ＤＮＡ片段。因为本实验使用的ＡＡＶ—ＭＣＳ载体的　ＩＴＲ两侧有相同的Ｎｏｔｌ酶切位点，利用此方法使融合片段　两端具有Ｎｏｔｌ酶切位点，使融合基因很容易与ＡＡＶ—　ＭＣＳ载体骨架进行连接，省去了多步酶切连接构建载体　［２］ＢＲＵ　ＣＥＭＥ，ＷＩＬＬ　Ｒ　Ｇ，ＩＲＯＮ　ＳＩＤＥ　ＪＷ．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ　ｔｏ　ｍｉｃｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ’ｎｅｗ　ｖａｒｉｎｔ’ＣＪＤ　ａｉｓ　ｃａｕｓｄ　ｅｂｙ　ｔｈｅ　ＢＳＥ　ａｇｅｎｔ［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８９：４９８—５０１：　的步骤。本实验把３个ＰＣＲ产物同时进行融合反应比　两两融合提高了融合效率，同时增加了保真性。　此ｐｒｎｐ基因敲除打靶载体的构建，为下一步基因敲　除小鼠的建立打下了基础，也为提高以ＡＡＶ作为基因敲　［３］ＢＵＥＬ　ＥＲ　Ｈ，ＦＩＳＣＨＥＲＭ，ＬＡＮ　Ｇ　Ｙ，ｅｔ　１ａ．Ｎｏｒｍａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐ—　ｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ｏｆ　ｉｃｅ　ｌｍａｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎａｉ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ＰｒＰ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６：５７７—５８２．　［４］Ｉｎｏｕｅ　Ｎ．，Ｄｏｎｇ　Ｒ．，Ｈｉｍｔａ　Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　１ａ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｔｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｓｅ　ｓｕｂｓｉｔｔｕｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｂｙ　ａｄｅｎｏ—・ａｓ—　除载体的打靶效率奠定了基础。ＡＡＶ载体无论是在基　因治疗方面还是基因打靶方面都将起重要的作用。　参考文献：　［１］Ｈｉｍｔａ　Ｒ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ　Ｊ．，Ｄｏｎｇ　Ｒ．，ｅｔ　１ａ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｂｙ　ａｄｅｎｏ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｓｏｃｉａｔｄ　ｅｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｔｈｅｒ．，２００１，（３）：５２６－５３０．　［５］Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｄ．Ｗ．，Ｈｉｒａｔａ　Ｒ．Ｋ．Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｂｙ　ｖｉｒａｌ　ｖｅｃ—　ｔｏｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，１８：３２５—３３０．　［６］ＭａｎｕＩ＜ｏＩｌｌｉ，ＣａｒｌｏＲａｇｏ，ｅｔａ１．Ｆａｃｉｌｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｉｔｎｇ　ｈｕ－　ｍａｌｌ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｅｌ／ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｄｅｎｏ—ａｓＳＯ＂　ｃｉａｔｄ　ｅｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２Ｏ０４，３２：１～８．　（上接第７４页）　４．３．２系统选择和匹配一般真空箱内最低工作压力　为０．６２６　ｋＰａ，此时温度达到０℃。在设计制冷系统蒸发　器时，应考虑气体通过时有较大的流导，同时又需考虑　捕获水蒸气的效率，翅片片距一般选用６　ｍｌｎ左右，制冷　系统蒸发温度一般设计为一１５～一１０℃。此外，可根据　设备的使用地点的具体气候环境和运行条件，确定制冷　系统高压部分采用的冷却形式和制冷系统冷凝温度，并　结合上述抽气流量、制冷负荷和蒸发温度，选择和设计　制冷压缩机、冷凝和蒸发盘管等相应的制冷部件，进行　制冷系统的匹配。　以蔬菜不被冻伤的温度为限。相关电气控制系统的设　计可根据设备运转程序采用ＰＬＣ程序并辅以触摸屏进　行控制和操作。　蔬菜真空预冷保鲜设备中包含抽真空系统、水喷淋　系统、制冷系统，设计时主要根据保鲜蔬菜的品种和重　量，设计放置蔬菜的货盘和真空箱体容积大小，从而确　定真空抽气负荷、水喷淋流量和制冷系统负荷，并进行　各系统部件的选择和配置。　参考文献：　［１］徐成海，张世伟，关奎之．真空干燥［Ｍ］．北京：化学工业出版　社，２００４．１．　５小结　真空冷却设备具有冷却速度快、从蔬菜表面到内芯　［２］达道安．真空设计手册［Ｍ］．北京：国防工业出版社，１９９１．６．　［３］尉迟斌．实用制冷与空调工程手册［Ｍ］．北京：机械工业出版　社，２００３．１．　冷却均匀、品质高、保鲜期长、损耗小、干净卫生、操作方　便、不受采摘时间等优点，但一般只用于叶菜类，如　白菜、甘蓝、菠菜、韭菜、菜花、春菊、生菜等。　真空预冷保鲜适宜的工作压力范围为６００～７００　Ｐａ．　（．Ｙ－４￣第７７页）　［１５］王爱民等．肌肽对心衰病人Ｎａ，Ｋ—ＡＴＰａｓｅ活性影响的研究　［Ｊ］．中国老年学杂志，１９９７，（５）：３６３—３６４．　［１６］Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｇ，Ｒｉｆｌｅ　ＭＤ，Ｐａｍｅｌａ　Ｒ，ｅｔ　１ａ．Ｖａｓｏｌｉｌａｔｏｒｙ　ａｃｉｔｏｎｓ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｉｄｅｔａｒｙ　ｐｅｐｆｉｄｅ　ｃａｍｏｓｉｎｅ［Ｊ］．Ｎｕｔｒｉｉｔｏｎ，２０Ｏｏ，（１６）：１６８—１７２．　［１７］谭竹钧，韩雅莉．肌肽对绵羊精子无氧酵解的影响［Ｊ］．动物　学研究，１９９５，１６（１）：３７～４１．　［１８］谭竹钧，韩雅莉．肌肽棉酚对绵羊精子运动及超微结构的影　［４］Ｓｔｅｖｅｎ　Ｗｏｌｆｅ．有效运用冷藏保鲜物流系统以提高农产品的价　值、市场的渗透力和最大限度减少损失［Ｊ］．农业科技与信息，　２００５，（１０）：３５—３６．　［２１］谭竹钧，韩雅莉．肌肽、棉酚对绵羊精子呼吸的影响［Ｊ］．生物　学杂志，１９９５，６３（１）：２３～２５．　［２２］ＤｅｃｋｅｒＥＡ，Ｌｉｖｉｓａｙ　ｓＡ，Ｚｈｏｕ　Ｓ．Ａｌ＇ｅ—ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｏｘ—　ｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｕｒｉｉｆｄ　ｃｅａｍｏｓｉｎｅ［Ｊ］．Ｂｉｃｈｅｉｓｍｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），　２０００，６５（７）：７６６－７７０．　［２３］殷定忠，柳卫国，吕锦芳，等．肌肽对肉仔鸡肌纤维发育的影　响［Ｊ］．家畜生态学报，２０Ｏ７，２８（６）：３４～３７．　［２４］吕锦芳，宁康健，金光明，等．肌肽对肉鸡生长性能及胸肌肉　品质的影响［Ｊ］．粮食与饲料工业，２００７，（７）：４１～４３．　［２＾５］东，吴金梅．肌肽的抗氧化性研究进展［Ｊ］．江西农业学　报，２００７，１９（４）：７９～８０．　响［Ｊ］．动物学研究，１９９５，１６（２）：１１９～１２５．　［１９］周宏博．蛋白质氧化羰基化和肌肽的保护作用［Ｊ］．中国老年　学杂志，２ＯＯ３，２３（５）：３１０—３１１．　［２ｏ］Ｋ．Ｓｏｌｉｍａｎ，Ａ．ＥＩ—Ａｎｓａｒｙ，Ｍｏｈａｍｅｄ　Ａ　Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃａｍｏｓｉｎｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｉｎ　ｂｉｌｈａｒｚｉａ—　［２６］Ｌｅｋｍｏｖ　Ｇ　Ｉ，Ｔｅｓｅ］ｋｉｎ　Ｙ．Ｅｆｅｃｔ　ｏｆｃｌｆｌ＇ｎｏ６ｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｎｆｒｅｅ—ｒａｄｉｃａｌ　ｒｅａｃｉｔｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｉ　Ｂｉｏ．，１９９８，１２（１）：８９～９９．　［２７］Ｎｉｓｓｅｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ．ＴｒｅａｔｍｅｎｔＯｐｔｉｏｎｓｆｏｒ　ＳｔｏｍａｃｈＵｌｃｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｏａｌ　Ｈｅａｌｔｈ，２Ｏ０２，２４（５）：７４３～７４６．　ｉｎｆｃｔｅｄ　ｅｈａｍｓｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｃｈｅｏｉｓｍｔｒｙ　ｎｄ　ａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　（Ｐａｒｔ　Ｂ），２００１，１５（１）：２１５７～１４．６