实时荧光定量PCR技术：定量分析功能及软件应用

 CT标准差小于0.5时候表示技术重复性好 实时荧光定量PCR技术：定量分析功能及软件应用 定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。 利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量： 用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。 点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。 若是使用SYBR Green I法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBR Green I的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。 同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。 完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。 利用定量技术进行基因型分析研究： 常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。 以下为用Taqman探针判断基因型的实例： 这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。 并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。 以下为用FRET方法分析基因型的实例： 如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因而打开这两组双链所需的能量就不同，具体体现在熔解温度的差异上，因而突变型的样本有较高的熔解温度，而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型；2号样本熔解温度较高，为突变型；而1、3、4号样品在高温和低温处都出现了熔解峰，则它们为杂合型。并且用户还可以将不同的峰定义为不同的基因型，软件可根据用户的定义自动给出未知样品的基因型。如上图表格中所示。 利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况： 基因表达研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。 Delta-deltaCt： 由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。 Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用： 1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2. 每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。 用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 下面是某科研用户用Delta-delta Ct进行相对定量分析的实例： 首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的M值判断该方法的可行性： 如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值<0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量。 确定这两个基因可以用Delta-delta Ct法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。经软件自动分析后，给出分析结果，如下： 我们看到，在该客户的实验中，以样品A为对照组，软件自动组出了样品B和C的目的基因相对于样品A的表达情况。 这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的客户特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。 双标准曲线法： 公式： 双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。 双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用： 1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。 2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。 每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。 下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。 要用该方法进行分析，客户在一轮反应中，对目的基因和看家基因分别做了一组标准曲线，同时也分别扩增的待测样品的目的基因和看家基因。 如下图，选择软件中相应的分析方法。 软件自动给出分析结果： 同样，结果自动给出了待测样品相对于对照组目的基因的表达情况。 比较定量法： 另一种相对定量分析方法叫比较定量法(ComparativeQuantitation)，该方法在芯片结果验证中的应用相对较多。 比较定量法的特点、注意事项及实际应用： 1．必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在芯片验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。 2．作为常规的基因表达研究，建议研究者使用前两种定量方法。 3．该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。 4．该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为unknown，分析时选用ComparativeQuantitation，确定对照组，完成分析。 应用实例： 用Comparative Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C，扩增目的基因。在软件中选择相应方法，即得以下结果： 上图左下方即相对表达量的结果，其中Rep.Conc为样品B、C相对于对照组A的目的基因浓度。右侧，可通过修改Calibrator Replicate改变对照组，以获得不同的比较结果。 、荧光定量分析方法 我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量；2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。 绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。 相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。 接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。 5．1绝对定量分析方法 5．1．1绝对定量分析方法的使用条件 在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取DNA，然后通过荧光定量PCR实验来确定HBV病毒DNA的copy数。通过病人样品的Ct值和设置梯度稀释的已知HBV对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中HBV病毒DNA的copy数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果最终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。 5．1．2绝对定量数据处理（举例）：确定某病人的血液提取的HBV病毒的精确量 如：PCR反应结束后，我们得到如下数据： copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD 5×103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.13 5×104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.08 5×105 21.11 21.04 21.16 21.10333 0.06 5×106 18.05 18.06 18.21 18.10667 0.08 BLANK None None None sample 23.25 23.46 23.39 23.36667 0.05 注：平行样的Ct值之间的差<0.5时表示重复性较好 直接从荧光PCR仪上就可以得到标准曲线： 从标准曲线可以看出： r2＝0.9995，大于0.98，标准差都在0.2范围内，而E=10-1/-3.2013=2.04，扩增效率＝（2.04－1）×100%=104%，表示定量准确，可将未知样品的Ct值带入方程： 23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得X＝2.33 所以copies＝(5×104/2) ×2.33＝5.825×104 但我们需要注意的是，标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量，而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以，我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。 5．2相对定量分析方法 5．2．1相对定量分析方法的使用条件 同绝对定量分析类似，我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异，相差多少倍？我们可以选择以下2种方式： 1)我们可以从等量的2种组织中提取RNA，分别进行目的基因的反转录特异性荧光定量PCR实验来确定目的基因在2种组织中的表达量，结果可以反映等量的2种组织中目的基因表达量的比率。 2）如果我们之前已经确定2种组织中看家基因如GAPDH的表达量相等，那么，我们就可以从大约等量（不需要等量）的2种组织中分别提取RNA，通过RT-qPCR实验来确定2种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由2种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。 2种分析方法的差异就在于用的标准有所不同，方法1）中的标准是2种组织的量相等；方法2）中的标准是2种组织中看家基因如GAPDH的表达量恒定不变； 5．2．2相对定量数据处理（举例――2-△△Ct法）：药物处理后和处理前某组织X基因表达量的变化 5．2．2．1溶解曲线绘制与分析 熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60℃升至95℃，每升高1℃仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰（如下图，左为GAPDH基因，右为X基因）。 5．2．2．2数据处理 样品 未处理样品 药物处理样品 X基因Mean Ct值 GAPDH基因Mean Ct值 △Ct △△Ct 2-△△Ct 26.52 20.34 6.18 24.18 20.12 4.06 -2.12 4.35 BLANK None None 下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的： 首先，分别求出6个重复样品X基因和GAPDH基因平均Ct值后，应用参照基因GAPDH对未处理样品和药物处理样品进行校正： △Ct（未处理样品）＝X基因 Mean Ct值－GAPDH基因 Mean Ct值＝26.52－20.34＝6.18 △Ct（药物处理样品）＝X基因 Mean Ct值－GAPDH基因 Mean Ct值＝24.18－20.12＝4.06 然后，对未处理样品和药物处理样品的△Ct进行归一化： △△Ct＝△Ct（药物处理样品）－△Ct（未处理样品）＝4.06－6.18＝-2.12 最后，我们就可以根据△△Ct算出药物处理样品与未处理样品间X基因的表达差异： 2-△△Ct＝2－(－2.12)＝4.35 因此药物处理样本的X基因的表达水平是未处理样品的4.35倍。 上述结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基因相对于校准样本，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。 为了更直观的表示样品间的表达差异，最后我们可以将计算得到的相对量用图表来表示，如下图： 2-△△Ct法的修正： 如果目标基因可参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，2-△△Ct法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为1.98，计算公式可以修正为1.98-△△Ct。