丁酸梭菌清液发酵工艺的研究

丁酸梭菌清液发酵工艺的研究

姓名：徐莹申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：梁运祥

20090601

丁酸梭菌清液发酵工艺的研究摘要丁酸梭菌，又名酪酸梭菌，１９３３年由日本的宫入近治博士首先发现，是存在于人和畜禽肠道的一种厌氧益生菌。丁酸梭菌作为微生态制剂，它能形成内生芽孢，具有耐高温、耐酸、耐胆盐、耐部分抗生素等特性，在日本等国广泛应用于调理人体肠胃的整肠药，能大幅降低肠炎的发病率，对菌群失调引起的腹泻，抗生素相关肠炎，便秘等有良好疗效，且无任何毒副作用，此外丁酸梭菌作为饲料添加剂和兽药，比非芽孢类活菌制剂有显著的优势。丁酸梭菌不耐贮藏，需要进行包被或放置在低温下。高含量菌粉可以减少包被成本和低温贮藏费用。为了获得高含量菌剂产品，本文采用了清液发酵策略。首先采用单因素实验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸膏。在此基础上，利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计对影响生物量的因素进行评价，筛选出具有显著效应的葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉等三个重要因素。用最陡爬坡路径逼近最大生物量区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，结果表明葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉最佳浓度分别为３．４％（ｗ／ｖ），４．Ｏ％（ｗ／ｖ），３．８％（ｗ／ｖ）。优化后培养基组分为：葡萄糖３．４％（ｗ／ｖ），胰蛋白胨４％（ｗ／ｖ），酵母浸粉３．８％（ｗ／ｖ），牛肉浸膏１．５％（ｗ／ｖ），可溶性淀粉Ｏ．１％（ｗ／ｖ），ＮａＣｌＯ．５％（ｗ／ｖ），乙酸钠Ｏ．３％（ｗ／ｖ），半胱氨酸０．０５％（ｗ／ｖ），Ｋ２ＨＰ０４Ｏ．２％（ｗ／ｖ），（ＮＨ４）２Ｓ０４Ｏ．１％（ｗ／ｖ），初始ｐＨ为７．１。采用上述优化后的培养基，可使发酵液中的生物量提高到３ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ，比优化前的６．９６ｘ１０７ｅｆｕ／ｍＬ提高了４．３倍，通过离心收集干燥后，每克干物质的菌数为５．５７ｘ】０ｌｏｃ如。关键词：微生态制剂；丁酸梭菌；Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计；响应面法丁酸梭菌清液发酵工艺的研究Ａｂｓｔｒａｃｔ‘Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ，１９３３ｂｙＤｒ．ｋｉｎｇ／Ｍｉｙａｉｒｉｆｉｒｓｔｆｏｕｎｄｉｎｈｕｍａｎａｎｄａｎｉｍａｌｅｘｉｓｔｅｎｃｅｉｎａｌｌａｎａｅｒｏｂｉｃｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．ＩｔＣａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｎｓｐｏｒｅ，ａｎｄｈａｖｅｓｔｒｏｎｇａｂｉｌｉｔｙｔｏｒｅｓｉｓｔｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ｌｏｗｐＨ，ｂｉｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｓｏｍｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍｉｎＪａｐａｎａｎｄｏｔｈｅｒｃｏｕｎｔｒｉｅｓａｓｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｈｕｍａｎｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｍｅｄｉｃｉｎａｌｄｒｕｇｕｓｅ，Ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｃｏｌｉｔｉｓｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｄｙｓｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓｃａｕｓｅｄｂｙｄｉａｒｒｈｅａ，ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｌｉｔｉｓ，ｃｏｎｓｔｉｐａ－ｔｉｏｎ，ｅｔｃ，ｈａｖｅａｇｏｏｄｅｆｆｅｃｔ，ａｎｄｗｉｔｈｏｕｔａｎｙｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓ．Ｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｅｅｄｓａｎｄｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｄｒｕｇｈａｓａｖｅｒｙｖａｓｔｐｒｏｓｐｅｃｔｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｎｏｎ－ｓｐｏｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．ＩｔｉｓｈａｒｄｔｏｓｔｏｒａｇｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍｄｉｒｅｃｔｌｙ，ｂｕｔｉｓｅａｓｙｔｏｂｅｃｏａｔｅｄｏｒｂｅｈｏｌｄｕｎｄｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ａｎｄｕｓｉｎｇｔｈｅｗａｙｏｆｃｏａｔｉｎｇａｎｄｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗｉｔｈｈｉ曲ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｐｏｗｄｅｒｗａｓｍｏｒｅｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ．Ｓｏｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｃｌｅａｒｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｗａｓｔａｋｅｎｔｏｏｂｔａｉｎｈｉ曲一ｃｏｎｔｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢ１，ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｈａｓｃａｒｒｉｅｄｏｎｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｔｏｉｔｓｃｌｅａｎｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ．Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ，ｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｃａｒｂｏｎｇｌｕｃｏｓｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｔｒｙｐｏｎｅ，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，ａｎｄｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｉａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔ，ｔｗｏｌｅｖｅｌｆａｃｔｏｒｉａｌｄｅｓｉｇｎｏｆＰｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｒｅｅｆａｃｔｏｒｓｐｌａｙｅｄｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍ，ｉｔＷａｓｇｌｕｃｏｓｅ，ｔｒｙｐｏｎｅａｎｄｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ．ＴｈｅｎｔｈｅｐａｔｈｏｆＳｔｅｅｐｅｓｔＡｓｃｅｎｔＷａｓｕｓｅｄｔｏａｐｐｒｏａｃｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅｇｉｏｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｍｂｉｎｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒｍａｘｉｍｕｍｂｉｏｍａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｇｌｕｃｏｓｅ３．４％，ｔｒｙｐｏｎｅ４．０％，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ３．８％．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｖａｒｉａｂｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓ：ｇｌｕｃｏｓｅ３．４％（ｗ／ｖ），ｔｒｙｐｏｎｅ４％（ｗ／ｖ），ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ３．８％（ｗ／ｖ），ｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔ１．５％（ｗ／ｖ），ｓｔａｒｃｈ０．１％（ｗ／ｖ），ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ），ＣＨａＣＯＯＮａ０．３％（ｗ／ｖ），ｃｙｓ０．０５％（ｗ／ｖ），Ｋ２ＨＰ０４０．２％（ｗ／ｖ），（ＮＨ４）２Ｓ０４０．１％（ｗ／ｖ），ｏｒｉｇｉｎａｌｐＨ７．１．ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢ１，ｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＷａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｆｒｏｍ６．９６ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬｔｏ３ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ，ｅｎｈａｎｃｅｄ４．３ｆｏｌｄｓ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅａｃｈｇｒａｍｄｒｙｍａｔｔｅｒｉｓ５．５７×１０ｌＯｃｆｕ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ；ＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＩＩ华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密移如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生签名：确象７又时间：如ｃ｝年６月歹日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并进行信息服务（包括但不限于汇编、复制、发行、信息网络传播等），同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文）在解密后适用于本授权书．学位论文作者签名：憾签名日期：二¨１年６月’日锄签名：膨多呼签名日期：土１年６月７日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１前言１．１研究背景自１９２９年弗莱明发现青霉素并随着用于临床以来，已经开发利用了百余种抗生素，他们在感染性疾病的治疗上发挥了巨大的作屠，有效地保障了人类的生命和健康，同时也积极推动了对畜牧养殖业的发展。随着科学认识的深入，人们在获得经济效益的同时，也发现越来越多由使用抗生素带来的负面影响：导致动物肠胃正常菌群失调（石现瑞和高峰，２０００）、药物残留、耐药菌株的产生（Ｌｅｖｙ．Ｓ．Ｂ，２００１）、动物机体抗病能力下降等问题已经引起人们的注意，尤其是动物肉、蛋、奶品质的下降，直接威胁到人类的健康和安全。为此，能替代抗生素、抗菌药物而又无副作用、无残留的新一代药物——微生态制剂应运而生。微生态制剂是促生素、益生素、生菌剂、益生菌、活菌制剂等的统称。对于微生态制剂的定义，到目前为止都还没有定论。学术界最推崇和认可的是Ｆｕｌｌｅｒ的定义，即益生素为一种可通过改（Ｆｕｌｌｅｒ，１９８９）善肠道菌群平衡而对动物施加有利影响的活的微生物饲料添加剂。但随着微生物技术的发展，这个概念又出现了其局限性。当前市场上销售的产品中，不少是包含了那些有益微生物及其发酵产物的。因此，微生态制剂的概念还有待权威专家根据微生态制剂的实际及未来发展趋势来重新定义。１．２微生态制剂的研究进展１．２．１微生态制剂的发展可以说饲用微生态添加剂发展到目前，已经经历了三个阶段（钟日聪和徐春厚，２００７）：第一阶段是用活菌或活菌处理过的日粮喂养畜禽，此过程中，细菌的菌体通常在饲料中被作为一种蛋白质源或日粮的改良剂使用。第二阶段是随着饲料加工工艺及相关技术的发展而衍生的微生物工业副产品，此过程是根据相关研究的成果用菌体提炼出来的作用针对性比较强的微生态产品。第三阶段是利用微生物发酵后的菌体成分、代谢产物及变性培养基复合起来形华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究成饲料添加剂。这类产品粗蛋白含量并不高，不像第一阶段的活菌体，不能将其作为一种蛋白质源使用。但是，其中含有大量细胞外代谢产物和经过充分发酵的已经变性的培养基。这些物质对于动物胃肠道中的微生物而言是绝好的营养底物。因此，其主要有效成分是其中的细胞外代谢产物及变性培养基而不是活菌数目。这三个发展阶段没有时间的界限，所取得的成果目前都在广泛应用。１．２．２微生态制剂的菌种各国规定允许使用的微生态制剂的菌种各有不同，１９８９年美国食品与药物管理局（ＦＤＡ）和美国饲料控制协会公布了可以使用的微生物菌种４２种；另外在欧洲市场上销售的微生态制剂也不下５０种。我国农业部２００３年公布允许使用的微生态制剂菌种为１５种，分别是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌（李研东，２００５）。目前用于微生物饲料添加剂的微生物主要有乳酸菌制剂、芽孢杆菌制剂和酵母菌类等真菌制剂（杜晋平，２００２）。１．２．３微生态学的理论假说（何明清，１９９４）１．２．３．１生态平衡理论生态平衡理论又称优势种群理论。微生态学认为，人体、动植物体表及体内寄居着大量的正常微生物群。宿主、正常微生物群和外环境构成一个微生态系统。在正常条件下，这个系统处于动态平衡状态。在微生态系统内微群落水平中，存在一种或数种优势群对整个群落起着决定作用，而微种群内部中优势个体的丧失则会引发微生态失调。在动物肠道系统微生态系中，厌氧菌占９９％以上，兼性厌氧菌和好氧菌不到１％。利用宿主体内的正常微生物优势菌群成员的益生菌，制成的微生态制剂，可以补充或恢复失调的优势种群，使宿主体内恢复正常的微生态平衡，达到防病治病的目的。２华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１．２．３．２生物夺氧理论根据正常微生物群的自然定植规律，人或动物出生时是无菌的，出生后不久就被一系列微生物细菌定植了。厌氧菌在整个微生态系统中其数量上占据首位，并保持着一定的生态平衡。多数病原微生物属于好氧菌或兼性厌氧菌，当动物肠道内微生态平衡失调会造成局部氧分子浓度升高，有利于病原微生物的生长和繁殖。使用微生态制剂可以培育好氧微生物，利用这些无毒、无害、非致病性微生物暂时在肠道内定植，降低局部环境中氧分子浓度，氧化还原电位下降，抑制病原菌的生长，恢复适合正常肠道优势菌生长的微环境，促进厌氧菌大量繁殖生长，从而达到预防和治疗疾病的目的。１．２．３．３生物屏障理论生物屏障理论又称生物拮抗理论，正常微生物群构成了机体的生物屏障和化学屏障。生物屏障是指有秩序的定植于黏膜、皮肤等表面或细胞之间的正常微生物菌群。化学屏障是指正常菌群的代谢产物，如乙酸、丙酸、乳酸、细菌素、抗生素及其它的具有活性抑菌物质。这些屏障可以阻止外源菌的定植和生长，发挥生物拮抗作用。１．２．３．４三流循环即能源流、物质流和基因流能源运转是指正常微生物菌群内部与宿主保持着能源交换和运转的关系。物质交换是指正常微生物菌群与宿主通过与宿主降解与合成进行物质交换。基因交换是指在正常微生物之间有着广泛的基因交换，如耐受因子、产毒因子等。微生态制剂作为非特异性免疫调节因子，促进吞噬能力和细胞产生抗体的能力，抑制微生物的过度生长，促进肠道内的有毒物质如氨、酚等的代谢，保证微生态系统的能量流、物质流和基因流的正常运转。３华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１．２．４微生态制剂的临床应用１．２．４．１在家禽饲养上的应用对鸡使用微生态制剂后，可以提高鸡的生产性能、饲料转化率、提高免疫力、降低死亡率等。冷寒冰等选用３日龄肉鸡１４０００只，随机分成２组，实验组口服功能型微生态制剂，空白对照组不饲喂任何微生态制剂，全程跟踪监测，结果表明，肉鸡在口服功能型益生菌制剂后表现出生长加快，鸡群整齐度与均匀度有所改善，出栏平均重提高９．５％；肠道环境有所改善，饲料利用率提高，实验组比对照组料肉比降低２．１６％；实验组鸡群可提前３～５天出栏（冷寒冰等，２００７）。黄云海以饮水方法投喂微生态制剂，结果表明，对照组在进雏后因肠炎死亡５１只；５周龄时发生散发性传染性法氏囊病，死亡４８只；６周龄后该组鸡群转入正常。试验组进雏后，因肠炎死亡３２只；在４周龄时鸡群中有部分发生传染性法氏囊病，死亡３７只；６周龄后直至出栏，该组鸡群均健壮活泼（黄云海，２００７）。余成瑶等对饲喂微生物饲料添加剂肉用仔鸡的小肠黏膜做了扫描电镜研究，结果表明：实验组鸡小肠黏膜皱襞增多，绒毛长度增长，黏膜陷窝加深，小肠吸收面积增大（余成瑶，１９９４）。在其他的研究中也表明饲喂益生菌可以使鸡小肠黏膜皱裂增多，绒毛长度增长黏膜陷窝加深。另外，有很多试验报道，日粮中添加益生菌能提高肉仔鸡机体的免疫力，降低料重比，并能提高产蛋鸡的产蛋率。张日俊等报道，用１０‰－－２％ｏ的含芽孢菌、乳酸菌和酵母菌等有益菌组成的活性微生物益生素饲喂肉仔鸡能明显提高饲料转化率和增重，同时能显著刺激胸腺、脾和法氏囊的发育，增强机体免疫能力和抗病力。何明清等综述中也指出，益生素可使蛋鸡产蛋重由２７．４９９／枚上升为４６．５９／枚，上升了１９．８９／枚，产蛋率由４４．３％提高到７４．３％，产蛋重与产蛋率明显优于其它对照组（何明清和倪学勤，２００２）。韩进程等在罗曼蛋鸡的日粮中添加０．０９％ｊＪＮ酶微生态制剂，结果实验组蛋鸡产蛋率较对照组显著提高７．１２％（韩进程等，１９９８）。日粮中添加ＹＣ可提高雏鸡日增重、饲料转化率、成活率，促进雏鸡生长；可提高雏鸡免疫器官指数和血清免疫球蛋白，增强了雏鸡机体免疫力（马明颖等，２００５）。４华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１．２．４．２在猪饲养上的应用很多试验报道在猪的日粮或饮水中添加微生态制剂，可以提高猪的日增重，增强其机体免疫力和饲料转化率，降低腹泻率和提高仔猪成活率。微生态制剂可以调整仔猪肠道内环境，抑制或杀灭病原微生物，进而激活体内的免疫系统发挥功效，提高仔猪抵御疾病以及安全度过断奶期的能力。黄红卫将含乳酸菌、酵母菌等复合有益活菌的微生态制剂添加到断奶仔猪饲料中，结果表明，仔猪料中添加微生态制剂的试验组比对照组平均日增重提高２２．２％差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），试验组料肉比比对照组降低了１６．８％，差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），采食量也增加了１．６３％（黄红卫，２００７）。Ｂａｉｒｄ和Ｐｏｌｌｍａｎ报道乳杆菌制剂能够提高生长猪的日增重和饲料转化率（Ｂａｉｒｄ．Ｄ．Ｍ，１９７７；Ｐｏｌｌｍａｎ．Ｄ．Ｓｅｔａ１．，１９８０）。Ｇｉｌｌ报道，用纯乳酸杆菌喂猪，仔猪日增重提高８１．６％，Ｂａｉｒｄ用混合乳酸杆菌喂猪，生长育肥猪日增重提高８１．４％，饲料报酬提高５１．８％。何明清等报道，微生物饲料添加剂（８７０１）可使生长育肥猪日增重提高１５％，饲料利用率提高１０．１３％。李春丽等用含Ｏ．１％微生态制剂的自来水饲喂母猪及其所产哺乳仔猪，为期４０天，结果表明：试验组的仔猪平均日增重提高８．３３％，发病率降低３０．３１％，试验组母猪的免疫球蛋白（ＩｇＡ）浓度一直维持不变，对照组浓度下降了４．２％（李春丽等，２００５）。邢宝松等研究表明添加酵母培养物可以改善母猪的繁殖性能，尤其倾向于提高胎儿的营养供应，且可以有效提高母猪分娩后的泌乳能力，从而提高哺乳仔猪的生长速度（邢宝松等，２００４）。马曙生利用ＥＭ发酵饲料培育断奶仔猪，实验表明仔猪腹泻率下降６５．６％，死亡率下降６．８％，日增重也显著提高（马曙生，１９９９）。１…２４３在反刍动物饲养上的应用反刍动物的消化主要在瘤胃进行，将适当比例的微生态制剂添加在牛的日粮中，可以有效的减少腹泻疾病的发生、增强免疫力，促进犊牛瘤胃的发育、提早断奶，提高产奶量。徐晶等在益生素的应用中提出，加拿大研究人员于犊牛出生后当日便饲喂给乳酸菌等混合发酵的初乳，结果犊牛日增重可达２３９－－２４８９，而对照组仅为１７８９（徐晶和金征宇，２００１）。李义海在奶牛中应用微生态制剂，可使奶牛产奶量提高７％一１０％，乳蛋白含量提高Ｏ．１—０．２个单位，乳脂率提高Ｏ．１一Ｏ．３个单位。尹召华报道，在日Ｓ华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究粮中添加益康ＸＰ能提高乳产量及乳成分含量，增强牛的体质；减少肠道疾病的发生；有助于产后的体况恢复，增强乳牛的繁殖性能（尹召华和杨万玉，２００２）。张扬等用添加微生态制剂的饲料饲喂荷斯坦奶牛，结果表明，试验组比对照组平均日产奶量提高了１．９７蚝，试验组试验后比试验前平均日产奶量提高１．９３ｋｇ，等于每天增收３．０５元（张扬等，２００５）。在羔羊的饲料中添加益生素有利于提高其生长速度，增强免疫力。钞海峰研究表明：羔羊日粮中添加Ｏ．１９／只・天剂量的益生素时，羔羊的生长速度及免疫功能均达到最佳状态（钞海峰，２００４）。任文军研究表明：添加益生素的羔羊的成活率和断奶体重明显要高于未添加益生素的羔羊（任文军，２００４）。１．２．４．４在水产养殖上的应用微生态制剂可以改善水质，抑制水产病原微生物的生产和繁殖、提高养殖对象的抗病力。主要表现在可以利用水环境中过多的有机物合成菌体物质，从而降低环境中氨氮、亚盐、硫化氢等有害有毒物质的含量，增加溶氧的含量，净化水产动物生存环境。微生态制剂中，主要是光合细菌可应用于水产养殖中，它除了能提高鱼类的抗病能力，改善水体质量，诱导贝类附着变态的微生物；当作为饲料添加剂使用时，可提供营养，提高饲料转化率，提高机体免疫力的同时还能改善肉的品质。Ｄｏｕｉｌｌｅｔ将细菌ＣＡ２作为饲料添加剂投喂太平洋牡蛎幼虫，促进了幼体的生长（ＤｏｕｉｌｌｅｔａｎｄＬａｎｇｄｏｎ，１９９４）。王彦波等在对虾池中分别加入光合细菌、芽胞杆菌以及不同的微生态制剂，待其生长繁殖后测定氨氮、亚盐、ＣＯＤ值和ｐＨ值，发现制剂对虾池水质具有明显的改善作用。方波等研究证明，微生态制剂可以明显净化盐碱地养殖水环境，有效降低水环境中的氨氮、化学耗氧量和碱度，提高对虾养殖产量（方波等，２００５）。刘克琳等研究了益生菌对鲤鱼免疫功能的影响，采用有益芽孢杆菌制成微生物添加剂，对鲤鱼的生长和免疫功能进行了试验，试验鲤鱼苗分２组，试验组添加１％微生态制剂，经１００天饲喂试验，结果证明，益生菌生态制剂对鲤鱼有促生长作用，试验组较对照组增质量提高１１．８％，饵料系数下降０．２４；试验组免疫器官胸腺和脾脏生长发育较对照组迅速且成熟快，电镜观察免疫器官内Ｔ、Ｂ淋巴细胞较对照组成熟快、数量增多且产生抗体增多，免疫功能增强；试验组前肠黏膜皱褶增多、隐窝加深、微绒毛长而密集，肠吸收面积增大，表明鲤鱼的消化功能增强（刘克琳和何明清，２０００）。６华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１．３丁酸梭菌研究进展１．３．１丁酸梭菌的来源、形态和生理特征丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ），即酪酸梭菌。１９３３年日本千叶医科大学医学系ＫｉｎｇｉＭｉｙａｉｒｉ博士从人的粪便中分离出丁酸梭菌（ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍＭⅣＡ瓜Ｉ），随后发现其具有极强的整肠作用，可以抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的生长。丁酸梭菌属于硬壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）梭菌纲（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）梭菌目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄａｌｅｓ）梭菌科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）梭菌属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）。它存在于土壤、人和动物肠道、干酪及自然酸奶中。丁酸梭菌是一种直或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，后期培养物可变为革兰氏阴性杆菌，菌体灰白色，呈煎蛋样，中间隆起（赵建新等，２００２），卵圆，单个或成对，短链，偶见长丝状菌体，周生鞭毛，具有运动性。菌体中常有圆形或卵圆形的巨大芽孢，无孢子外壁和附属丝，形成芽孢后一端膨大呈鼓锤状，或中部膨大呈梭状或纺锤状（冉雪松等，２００７）。丁酸梭菌在琼脂平板上形成白色或奶油色的小规则圆形菌落，不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等碳水化合物产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。发酵产物主要有丁酸、乙酸、甲酸、丁醇、乙醇、氢气、二氧化碳、１，３．丙二醇；ＤＮＡ的Ｇ＋Ｃ含量（ＧＣ％）为２７．２８（杨桂平，１９９８）。１．３．２丁酸梭菌的生理功能及应用１．３．２．１丁酸梭菌对肠道菌群的作用丁酸梭菌可以产生淀粉酶，水解淀粉和碳水化合物生成低聚糖，这些低聚糖更容易被双歧杆菌和乳酸菌利用。朱晓慧等通过体外培养证明，在双歧杆菌菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的培养基中加入１／３比例的丁酸梭菌发酵提取物，．液体培养２４小时，三种菌的活菌含量分别比对照组提高了２４．００％、４２．５７％和６．６７％（朱晓慧等，２０００）。另丁酸菌酪可增加肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促进排便，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门７华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究氏菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌等有害和菌的生长繁殖（张树波等，２００２）。１．３．２．２促进生长功能丁酸梭菌体内存在着蛋白酶Ｉ和蛋白酶ＩＩ及脂肪酶，其能促进动物对脂肪和蛋白质的消化吸收，丁酸梭菌还具有氨基酸载体的作用，能转运所有的氨基酸，但不分解，所有这些都有利于促进动物生长。李恕等将酪酸菌制剂用于水产类，结果鱼及特种水产类日增重率提高大约１５％－４０％，杂食性鱼类可提高２２％以上（李恕和丛宁，１９９８）。１．３．２．３免疫调节功能丁酸梭菌能激活免疫系统，促进免疫功能，维持机体的健康状况。当机体摄食丁酸梭菌死菌体（１０９个／克）后，从小肠上皮细胞无菌取出派伊尔氏淋巴结细胞，用ＥＬＩＳＡ法测定血清中免疫球蛋白ＩｇＡ含量，实验组（６ｌｘｇ／ｍＬ）明显高于未摄食菌体的对照组（０．５ｌｘｇ／ｍＬ）。１．３．２．４提供营养元素丁酸梭菌在发酵过程中能产生葡萄糖、麦芽糖等６种糖，及维生素Ｅ。这些物质直接为动物提供营养元素，维生素Ｅ能强化血管，增强抗病性，激活细胞，对机体非常重要（冉雪松等，２００７）。丁酸梭菌在体内能产生Ｂ族维生素、维生素Ｋ等，对机体具有保健作用。同时其主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。１．３．３丁酸梭菌的应用开发现状１９９９年２月由联合国粮农组织（ＦＡＯ）和世界卫生组织（ｗＨｏ）联合召开的第５２次食品添加剂专家委员会强调指出酪酸梭菌是人的正常肠道菌（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／／ｐｃｓ／ｊｅｃｆａ／ｓｕｍｍａｒｙ＿５２．ｐｄｆ）。此后，人们广泛的关注和研究了酪酸梭菌的形态特征、生理特点、生化特点及其商业应用。另外，ＮＡＲＩＴＡ等人研究了酪酸梭菌对重金属的抗性（ＮＡＲＩＴＡｅｔａ１．，２０００）；酪酸梭菌的非共生固氮能力也８华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究引起了人们的注意（ＰＡＲＫＥＲＡＣ，１９５４）。１９４０年，丁酸梭菌在日本实现了商业化生产并被应用于临床。最初它被用作整肠剂，广泛用于肠道菌群失调，急慢性腹泻，肠易激综合症，抗生素相关性肠炎等疾病的治疗，取得了显著疗效。此后，它先后被作为处方药、非处方药、兽药、饲料添加剂、食品添加剂等广泛使用。在韩国，酪酸梭菌也已经被用于牛、猪及家禽的饲料添加剂（ｈｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ．ｈａｎｄｏｎｇｖｅｔ．ｃｏ．ｋｒ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｐｒｏｄｕｃｔａ／ｐｒｏｄｕｃｔａ０７．ａｓｐ）。丁酸梭菌能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用，能增强其功效（张雪平等，２００１）。我国市场上进口药用丁酸梭菌产品主要是日本米雅利桑制药株式会社生产的米雅ＢＭ片剂（ＭⅣＡＢＭＴＡＢＬＥＴＳ），治疗肠道菌群紊乱引起的肠炎、腹泻、消化不良等，效果显著。２００４年我国青岛东海药业有限公司的口服酪酸梭菌活菌胶囊的新药证书（￥２００４００８４）获得国家食品和药品监督管理局的批准。此外，山东科兴生物制品有限公司生产的口服酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌剂（ＯｒａｌｂｕｔｙｒｉｃｕｍａｎｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣａｐｓｕｌｅ，Ｌｉｖｅ），重庆泰平药业有限公司生产的酪酸ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ梭菌活菌胶囊（ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＣａｐｓｕｌｅ）也纷纷上市。在酪酸梭菌的研究开发和商业化的生产过程中，形成了许多专利。日本拥有的酪酸梭菌相关专利比较多，中国、美国、法国、德国和英国等国家的知识产权机构也都受理和批准了一些相关专利。酪酸梭菌相关专利涉及的应用相当广泛，除了酪酸梭菌本身的分离培养、规模化生产等专利外，有利用其预防和治疗人类或动物疾病方面的，例如治疗肠道疾病、肝脏疾病、癌症等；有利用其作为保健品的专利；有利用其促进动物或植物生长方面的专利；还有利用其生产氢气等能源开发方面的专利。可见，现在关于酪酸梭菌的研究正日益深入和广泛，其产品市场更是蓬勃发展（李雄彪等，２００８）。１．４课题的立题依据和目的及意义丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）比普通的其它的益生菌（女ｎ－ｇＬ杆菌、双歧杆菌和肠球菌）有更强的耐酸、耐胆汁特性，能更适应动物肠道环境，具有很大的应用价值。近年来国内对丁酸梭菌的研究多集中在医学方面，饲料方面的研究也逐渐升温。因此，对丁酸梭菌培养基的优化研究有其实际意义，但丁酸梭菌不耐贮藏，需要进行包被或放置在低温下，所以高含量菌粉可以减少包被成本和低温贮藏费用。９华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究目前用于丁酸梭菌发酵的主要氮源为大豆饼粉，因其不可溶，所以发酵后得到的是菌粉实际上是菌体和发酵大豆饼粉后的混合物，不能得到高含量的菌体。基于上述现状，本文采用清液发酵的策略，通过在大量碳源、氮源等培养基成分筛选的基础上，运用数学统计中优化效果最为显著的响应面方法，在ＳＡＳ统计软件的帮助下，得到适合工业化生产的清液发酵工艺，通过离心处理便可以得到大量纯净的菌体。ｌＯ华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究２实验材料和方法２．１实验材料２．１．１主要仪器设备表２．１仪器和设备Ｔａｂｌｅ２．１ｔｈｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄＥｑｕｉｐｍｅｎｔｓ主要仪器电子精密天平冰箱厂家奥豪斯公司；ＳＩＥＭＥＮＳ：Ｎｉｋｏｎ相差显微镜ＰＨＳ．３Ｃ型精密酸度计ＢＣＮ．１３６０型生物洁净工作台ＤＨＰ．１２０型恒温培养箱ＢＤ上海虹益仪器仪表有限公司；北京东联哈尔仪器制造有限公司；上海实验仪器厂有限公司；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪７５２型紫外可见分光光度计ＴＤＬ．５型离心机上海第三分析仪器厂；上海安亭科学仪器；上海安亭科学仪器；ＴＧＬ．１６Ｃ型离心机ＤＨＧ９０Ａ型烘箱Ｒ０８０８１型灭菌锅上海索谱仪器有限公司；武汉市鸿雁医疗器械制造有限公司。２．１．１实验菌株丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）Ｂ１，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室发酵工程室保藏，分离于湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八镇基酒基地酒窖底泥（谢树贵等，２００７）。２．１．２培养基（１）种子培养基（梭菌增殖培养基，简称ＲＣＭ培养基）：酵母浸膏３ｇ、牛肉浸膏１１华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵Ｔ艺的研究１０ｇ、胰蛋白胨１０ｇ、葡萄糖５ｇ、可溶性淀粉１ｇ、氯化钠５ｇ、三水合乙酸钠３ｇ、半胱氨酸盐酸盐０．５ｇ、０．５％美蓝０．２ｍＬ、蒸馏水１０００ｍＬ；调节ｐＨ７．１４－０．１，１１５℃，２０ｍｉｎ灭菌备用。（陈天寿，１９９５）（２）初始发酵培养基：酵母浸膏３ｇ、葡萄糖５ｇ、可溶性淀粉１ｇ、氯化钠５ｇ、三水合乙酸钠３ｇ、磷酸氢二钾２ｇ、硫酸铵１ｇ、半胱氨酸盐酸盐Ｏ．５ｇ、Ｏ．５％美蓝０．２ｍＬ、蒸馏水１０００ｍＬ；调节ｐＨ７．１４－０．１，１１５℃，２０ｍｉｎ灭菌备用。２．２实验方法由于丁酸梭菌属严格厌氧菌（ＨａｍｂｌｅｔｏｎａｎｄＲｉｇｂｙ，１９７０），在有氧条件下无法生长，传统的培养方式多选用焦性没食子酸法（夏淑兰，１９８８），现在多采用厌氧工作台或厌氧罐培养，但实验成本相对较高。本实验在培养方法和计数方式都做了相对改进。２．２．１丁酸梭菌的发酵方法取．２０℃甘保藏的菌种２００“Ｌ接种于装有９ｍＬＲＣＭ培养基的试管中，３７℃条件下静态厌氧活化４８ｈ。将活化好的菌种按１％（ｖ／ｖ）的接种量转接到灭过菌的发酵培养基中（培养基组成按设计中的所取的水平进行）。３７。Ｃ条件下静态厌氧培养２４ｈ～３６ｈ以达到最大生物量。发酵培养基装于１８ｘ１８０ⅡｌＩｌｌ的试管中，装液量为１５ｍＬ，加约２ｃｎｌ厚的液体石蜡液封。培养基灭菌后若放置超过４ｈ，在使用前都需要沸水浴１０ｍｉｎ驱氧，直到美兰指示剂的蓝色褪去。２．２．２丁酸梭菌的计数方法采用稀释平板计数法在厌氧条件下培养，不但工作量大而且实验成本较高，本实验采用分光光度计比色法和流式细胞仪测定菌数相结合的方式，既定性又定量的对发酵结果进行评定，方法快速且准确。２．２．２．１分光光度计比色法将培养液于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤２次，在１２华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究６５０ｎｒｒｌ处测其吸光度值ＯＤ６５０，采用此方法定性反应生物量的多少（孔青，２００６）。２．２．２．２流式细胞仪测定菌数（１）标准曲线的制作将培养液于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤２次，稀释一定倍数使吸光度值落在Ｏ．２—０．８范围内（得到４个样品），以蒸馏水校正零点，在６５０ｎｍ处侧其吸光度值ＯＤ６５０。将上述４个样品经流式细胞仪（ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂ矗刑）测定菌体浓度，并绘制菌体浓度（ｙ）．吸光度（ｘ）标准曲线（见图２．１），求出标准直线方程ｙ＝２５．２４ｘ．０．４３２，Ｒ２＝Ｏ．９９８。坫”为一Ｘ心＝￡＼ｏＵ∞８６４０。４ＯＤ渤圈２．１菌体浓度标准曲线Ｆｉｇ．２．１Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒ（２）计算发酵液中的菌体浓度将培养液于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤２次，稀释一定倍数使吸光度值落在Ｏ．２一Ｏ．８范围内，以蒸馏水校正零点，在６５０ｎｍ处侧其吸光度值ＯＤ６５０。将吸光度值带入标准曲线得到稀释后的菌体浓度，再乘以稀释倍数即得到发酵液的菌体浓度。２．２．３丁酸梭菌浓缩菌体的计数将培养液于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤２次并用滤纸吸干水分，平均分为两份。将其中一份溶于蒸馏水测定吸光度带入菌体浓度标准曲线计算出菌体浓度；另一份置于１０５＂Ｃ烘箱２ｈ烘干，计算出干物质的含量。二１３华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究者相除便是每单位干物质含有的菌体浓度。２．２．４还原糖测定方法－３，５．二硝基水杨酸法（ＤＮＳ法）积，１９８２）（１）标准曲线的制备（蔡武城和厚精确吸取葡萄糖标准储备液０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、Ｏ．８ｍＬ、１．０ｍＬ、１．２ｍＬ分别置于比色管中，各管补蒸馏水至体积为２．０ｍＬ。按顺序向比色管中加入３，５一二硝基水杨酸溶液２．０ｍＬ，摇匀，在沸水中加热５ｍｉｎ，取出后立即用流水冷却，加蒸馏水定溶至２０ｍＬ。另取蒸馏水２ｍＬ，同上操作加３，５一二硝基水杨酸溶液，沸水加热进行显色反应，作为空白对照，于５４０ｎｔｏ处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖含量为纵坐标，绘制标准曲线（见图２．２），求出标准直线方程Ｙ＝１．８３４ｘ＋０．０２７１４１２ｌＯ８０６Ｏ４∞＼遐辫爨帮耀０２Ｏ００．１０．２０．３０．４０。Ｓ０．６０．７吸光度图２．２３，ｏ二硝基水杨酸测还原糖标准曲线Ｆｉｇ２．２ＳｔａｎｄａｒｄｃａｌｖｅｏｆｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｗｉｔｈＤＮＳ（２）样品测定将培养液于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取上清Ｏ．５ｍＬ置于比色管中（重复３次），加蒸馏水１．５ｍＬ，同制作标准曲线步骤，按顺序分别加３，５一二硝基水杨酸溶液，沸水加热，显色并测定吸光度。由标准曲线方程求葡萄糖的含量，计算测试样品中还原糖的含量。１４华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵Ｔ艺的研究２．３实验设计２．３．１丁酸梭菌培养基优化实验２…３１１单因素实验筛选碳源、氮源改变初始发酵培养基中碳源的种类，分别以１％的葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、糖蜜（３６．１％）作为碳源进行最适碳源的筛选。以筛选出的最佳碳源为碳源，分别以１％的胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、蛋白胨、大豆蛋白胨和尿素，（ＮＨ４ｈＳ０４、ＮａＮ０３、ＮＩ－１４Ｎ０３作为氮源进行最适氮源的筛选。（ＸｉａｏｙｉＷａｎｇ２００８）ｅｔａ１．，２．３．１．２ＰｌａｃｋｅＲ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选影响丁酸梭菌清液发酵的显著因素Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计法（胡运权，１９９７）是一种两水平的实验设计方法，它基于非完全平衡块原理，试图用最少的实验次数尽可能精确的估计出因素的主效果，适用于从众多因素中快速有效地筛选出最重要的因素。每个因素取高（＋１）低（．１）两个水平（本实验以单因素实验得出的最佳浓度作为中心值），以Ｙ（ＯＤ６５０）做为响应值。运用ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）９．１软件分别计算各因素的效应值，并对各因素效应值进行ｔ检验（Ｋ．Ｎ．Ｎｉｌａｄｅｖｉ素进行下一步考察。ｅｔａ１．，２００６），选择置信度较高的因素作为显著因２．３．１．３最陡爬坡实验确定响应面实验因素水平的中心点响应面拟合方程只有在考察的邻近区域里才能较好的反映真实情形，所以，应先逼近最大生物量区域后再建立有效的拟合方程。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ法筛选出显著因素效应大小设定它们的步长，进行最陡爬坡实验设计，寻找最大生物量区域（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，１９９１）。变量取值的增减由Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ实验设计得到的回归方程的系数确定，如系数为正，表明增大此变量的取值对应变量的效应为正，如系数为负，表明减小此变量的取值对应变量的效应为正。１５华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究２．３．１．４中心组合设计（Ｃｅｎｔｒａｌ．素的最优水平响应面方法（ＲｅｓｐｏｎｓｅＣｏｍｐｏｓｉｔｅＤｅｓｉｇｎＴｙｐｅ）及响应面分析确定显著因ＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。其中，由Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ和Ｂｏｘ．Ｗｉｌｓｏｎ提出的中心组合设计是两种较常用的ＲＳＭ法，适用于２．５个因素的优化实验。Ｂｏｘ．Ｂｅｈｎｋｅｎ设计法每个因素取３个水平，以（．１，０，１）编码（褚以文，１９９９）。以实验结果拟合建立描述响应量（生物量）与自变量（影响生物量的显著因素）关系的多项式回归模型，运用ＳＡＳ９．１软件程序对实验数据进行回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，并对拟合方程做显著性检验及方差分析。再对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定点，得到最大生物量时显著因素的最优水平。２．３．２丁酸梭菌在优化后培养基中的代谢曲线２．３．１．１生长曲线、ｐＨ代谢曲线的测定－・利用优化后的培养基进行丁酸梭菌的生长曲线和ｐＨ变化的测定，取９６只装有１５ｍＬ优化后培养基的试管，将于ＲＣＭ培养基中活化的丁酸梭菌以１％接种量接种到培养基中，３７℃条件下静态培养。从接种时刻作为０小时进行第一次测定ＯＤ６５０和ｐＨ，每２ｈ取出３支混匀后测其ＯＤ６５０值、ｐＨ值，取平均值。ＯＤ６５０测定方法同２．２．２．１中，ｐＨ值则是使用ｐＨ计测定。共测３２次、６０小时，得到菌的生长曲线和ｐＨ变化曲线。２．３．１．２葡萄糖代谢曲线将活化好的丁酸梭菌按１％的接种量接种到装有优化后培养基的试管中，３７℃条件下静态培养，每２ｈ取出３支分别混匀后于４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取上清测定还原糖含量，将沉淀用无菌水洗涤２次测定吸光度，取其平均值绘制生长曲线、残糖曲线。１６华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵Ｔ艺的研究２．３．１３间歇调节发酵液ｐＨ对生物量的影响在放大的培养容器中控制发酵过程的ｐＨ，并测定菌体浓度，以比较试验组（对发酵过程ｐＨ进行控制）和对照组（不对ｐＨ进行调整）的菌体浓度。实验组是在丁酸梭菌培养８ｈ时将ｐＨ调回至７．３，继续培养１２ｈ后测定其菌体浓度，与对照组（静置培养２０ｈ）进行比较。２…３１４优化的培养基发酵性能的对比目前在报道的清液培养基优化中，尤其孔青（２００６）的培养基配方得到的菌体浓度最高，其培养基成分为：葡萄糖（２．４４％）、酵母膏（２．０８％）、胰蛋白胨（１％）、硫酸铵（０．１％）、ＮａＨＣ０３（０．１％）、ＭｎＳ０４・Ｈ２０（Ｏ．０２％）、ＭｇＳ０４・７Ｈ２０（０．０２％）、ＣａＣｌ２（Ｏ．００２％），初始ｐＨ为８．５５，菌数可达１．０３ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬ（孔青，２００６）。实验将丁酸梭菌Ｂ１置于原始发酵培养基、本实验得到的优化培养基与孔青（２００６）得到的优化培养基在相同条件下进行发酵培养，比较其发酵性能。１７华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究３结果与分析３．１丁酸梭菌培养基优化实验３．１．１单因素实验筛选碳源、氮源３．１．１．１最佳碳源的确定碳源在葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、糖蜜（３６．１％）中筛选。固定初始发酵培养基的其他成分不变，碳源分别取１％，培养２４ｈ后，在６５０ｒｉｍ处测其吸光度值ＯＤ６５０。结果见图３．１。Ⅺ１＾１－ｌ的ｌ∞１．１００．９００．７０葡萄糖乳糖蔗糖可溶性淀粉果糖糖蜜圈３．１不同碳源对生物量的影响Ｆｉｇ．３．１Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｂｉｏｍａｓｓ从结果可以看出，葡萄糖的最适的碳源。碳源确定，后又对其浓度进行了筛选，培养２４ｈ后，在６５０ｎｍ处测其吸光度值ＯＤ６５０。结果见图３．２。１８华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究斟成苗Ｑｏ啊｛辱刊Ｍ船聪Ｍ０．５％１１．慨１．溉２．ｏ％２．Ｓ％３．０９６图３．２葡萄耩浓度对生物量的影响Ｆｉｇ．３．２Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅｌｅｖｅｌｏｎｂｉｏｍａｓｓ从以上结果可以看出，葡萄糖的最适浓度为２％。３．１．１．２最佳氦源的确定氮源在胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、蛋白胨、大豆蛋白胨和尿素、ＮａＮ０３、（ＮＨ４）２Ｓ０４、ＮＨ４Ｎ０３中筛选。固定初始发酵培养基中其他成分不变，碳源葡萄糖取２％，氮源分别取１％，培养２４ｈ后，在６５０ｎｍ处测其吸光度值ＯＤ６５０。有机氮源筛选结果见图３．３，无机氮源筛选见图３．４。１。８０１．６０Ｑｏ善１．４０捌ｌ。２０Ｓ删１．０００．８０胰蛋白胨酵母浸粉牛肉浸膏蛋白胨大豆蛋白胨图３．３不同有机氮源对生物量的影响Ｆｉｇ．３．３Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｂｉｏｍａｓｓ１９华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究Ｏ．１１Ｏ．１０苦０．０９Ｏ型０．０８粹划０．０７Ｏ．０６Ｏ．ＯＳ尿素｛ＮＨ４）２Ｓ０４ＮａＮ０３ＮＨ４Ｎ０３圈３．４不同无机氮源对生物量的影响Ｆｉｇ．３．４Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｉｎｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｂｉｏｍａｓｓ由上面两图可以看出，有机氮源中胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸膏的效果较好，无机氮源中（ＮＩ－１４）２Ｓ０４的效果较好，考虑到速效氮源和迟效氮源的搭配，故选胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏和（ＮＨ４）２Ｓ０４为复合氮源。氮源选好后，又对各种有机氮源的浓度进行了筛选，培养２４ｈ后，在６５０ｒｉｍ处测其吸光度值ＯＤ６５０。结果见图３．５．３．７。１．６２１．６１．５８１．Ｓ６盘１．Ｓ４ｏ卿１．５２翥１．ｓ１．４８１．４６１．４４１％图３．Ｓ胰蛋白胨浓度对生物量的影响Ｆｉｇ．３．５Ｅ仟ｅｃｔｓｏｆｔｒｙｐｔｏｎｅｌｅｖｅｌｏｎｂｉｏｍａｓｓ华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１一Ｉ名ＳＬ８７Ｓｏｕ１Ｌ７１工１－Ｉ∞ｏｏ石５Ｌ６啊ｌＳ刊１＿Ｉ５５ＬＳ４Ｓ％１％１．５０％２％２．５０％１工圈３．６酵母浸粉浓度对牛物量的影响Ｆｉｇ．３．６Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔｌｅｖｅｌｏｎｂｉｏｍａｓｓ１．６ａｏ州翥１．５Ｏ１％圈３．７牛肉浸膏浓度对生物量的影响Ｆｉｇ．３．７Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔｌｅｖｅｌｏｒｌｂｉｏｍａｓｓ如图可知，最终选择的有机氮源及其浓度分别为胰蛋白胨２％，酵母浸粉２％，牛肉浸膏１．５％。无机氮源（ＮＩ＾）２Ｓ０４１％。２１华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭茵清液发酵工艺的研究３．１．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选影响丁酸梭菌清液发酵的显著因素Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计及实验测得的生物量结果见表３．１各因素所代表的参数、水平及因素效应评价见表３．２选用Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ实验是来寻找酵母浸粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖、ＫａＨＰ０４、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２Ｓ０４、和初始ｐＨ这８个因素中哪些因素对菌体生长有显著因素。从表３．１可知，ＯＤ６５０（定性反应菌体浓度的多少）变化范围比较大，从０．７９１到１．８４２。从表３．２的显著性检验结果可知，酵母浸粉和葡萄糖极显著的影响着菌体浓度（ｐ＜Ｏ．０１），胰蛋白胨显著影响着菌体浓度（ｐ＜Ｏ．０５），并且都呈现出正效应。说明要提高生物量，应当适当提高这三者的浓度。其他因素对生物量的影响不显著，维持在原有水平。表３．１Ｎ－－８的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计及结果Ｔａｂｌｅ３．１ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｏｆＰｌａｃｋｅｔｔ－ＢｕｒｍａｎａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓＲＵＮ酵母浸粉１２３４５６７８９ｌＯ１１１２１１—１１ｌ１一ｌ．１—１１一ｌ－ｌ牛肉浸膏胰蛋白胨Ｋ２ＨＰ０４葡萄糖ＮａＣｌ（ＮＩ－１４）２８０４－ｌ１１一ｌ１１１－ｌ－１—１ｌ一１１一ｌ１ｌ・１１１ｌ一ｌ．１・１一１．１１．１１ｌ．１１●。起始ｐＨｌ１．１．１．１ｌ．１１ｌ．１１．１Ｙ（ＯＤ６５０）１．１１５１．０９７１．３６７１．２３３１．５７２１．８４２０．９１０１．２６７１．１５３１．４９２０．８７１０．７９１．１．１１．１１１．１１１ｌ．１．１．１．１．１１．１１＿ｌ．１ｌ１ｌ．１’・ｌ．１．１．１１．１１１一１１１．１１１．１．１．１华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究表３．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计的各因素水平及效应评价（萨０．０５，置信度９５％）Ｔａｂｌｅ３．２Ｆａｃｔｏｒｓ，ｌｅｖｅｌｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｅｓｔｉｍａｔｅｓｏｆＰｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎ３．１．３最陡爬坡实验确定响应面实验因素水平的中心点酵母浸粉、胰蛋白胨和葡萄糖三者浓度的步长均取＋０．５。最陡爬坡实验设计及实验测得的生物量结果见表３．３。由表３．３可知，随着酵母浸粉，胰蛋白胨和葡萄糖浓度的提高，菌体浓度也在提高，最大的菌体浓度出现在第４次实验附近，再往后，随着酵母浸粉，胰蛋白胨和葡萄糖浓度的提高，菌体浓度反而有小的下降。这说明，最优点就在第４次的条件左右。因此以实验４的条件为响应面实验因素水平的中心点，响应面实验因素水平见表３．４。表３．３最陡爬坡实验设计及结果Ｔａｂｌｅ３．３Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｏｆｓｔｅｅｐｅｓｔａｃｃｅｎｔａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究表３．４响应面中心组合设计的因素及水平Ｔａｂｌｅ３．４Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎ３．１．４中心组合设计（ＣｅｎｔｒａｌＣｏｍｐｏｓｉｔｅＤｅｓｉｇｎＴｙｐｅ）及响应面分析确定显著因素的最优水平逼近最大生物量区后，进行响应面中心组合实验设计，以实验结果拟合建立描述响应量（生物量）与自变量（影响生物量的显著因素）关系的多项式回归模型，运用ＳＡＳ９．１软件程序对实验数据进行回归拟合，并对拟合方程做显著性检验及方差分析。再对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定点，得到最大生物量时显著因素的最优水平。三因素三水平的响应面中心组合实验设计及实验测得的结果见表３．５。表３．５响应面中心组合实验设计及结果Ｔａｂｌｅ３．５Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究３．１．４．１回归模型的建立及置信度分析由ＳＡＳ９．１软件拟合得多项式回归模型为：Ｙ（ＯＤ６５０）＝１．９２９．０．０２３５＂Ｘ１—０．０１１８７５＂Ｘ３＋０．０１９１２５＂Ｘ５．０．０４９２５＂Ｘ１・Ｘ１＋０．０２７２５＂Ｘ１木Ｘ３．０．０４４５＂Ｘ３宰）【３．０．０５７＊Ｘ５＊Ｘ５回归方程系数的估计见表３．６，方差分析见表３．７（Ｆ．Ｊ．Ｃａｉｅｔａ１．，２００６）。由表３．６、表３．７可知在ａ＝０．０１水平上，该模型失拟不显著，回归显著。决定系数Ｒ２值为９７．７４％，说明该模型与实际情况拟合良好，可以用上述模型代替真实实验点对丁酸梭菌清液发酵进行分析和预测。表３．６回归模型系数的估计Ｔａｂｌｅ３．６ＥｆｆｅｃｔｓｅｓｔｉｍａｔｅｓｆｏｒＹ（ＯＤ６ｓｏ）华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究表３．７回归模型的方差分析Ｔａｂｌｅ３．７ＡＮＯＶＡｏｆｑｕａｄｒａｔｉｃｐｏｌｙｎｏｍｉａｌｍｏｄｅｌ３．１．４．２显著因素水平的优化从图３．８响应面分析的三维立体可知，回归模型存在稳定点（Ｘ１，Ｘ３，Ｘ５）的编码值为（－０．３１７１０，．０．２４２６０，Ｏ．１９５４６），即（３．８６５７９，４．０１４８１，３．３９０９２），此时Ｙ（ＯＤ６５０）的最大估计值为１．９３６，结果见表３．８。为方便操作，可以分别取值（３．８，４．０，３．４）。即当酵母浸粉、胰蛋白胨和葡萄糖浓度分别为３．９％，４．Ｏ％，３．４％时，该模型预测的最大生物量为１．９３６。十中Ａｎ大学２００９届目・十学位论女Ｔ醴棱菌浦液发酵Ｔ艺的Ⅻ究葡萄艟酵母浸耪＝４５图３．８各因素对生物量的反应曲面Ｆｉｇ．３．８Ｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｏｆｂｉｏｍａｓｓａｓｒｅｓｐｏｎｓｅ华中农业大学２００９届硕十学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究表３．８规范形分析寻求稳定点Ｔａｂｌｅ３．８Ｃａｎｏｎｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ：ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｐｏｉｎｔｆｏｒＹ（ＯＤ伽）为了检验模型预测的准确性，在原始条件（酵母浸粉０．３％，胰蛋白胨１％，葡萄糖０．５％）和最佳条件（酵母浸粉３．９％，胰蛋白胨４．ｏ％，葡萄糖３．４％）下，分别进行发酵实验，每组做５个重复，将测得的吸光度值带入菌体浓度（ｙ）．吸光度（ｘ）标准曲线，得到菌体浓度见表３．９。由表３．９可知，在最佳条件下，发酵实验数据稳定，且菌体浓度为３ｘ１０８ｃｆｉｇｍｌ，较原始条件（６．９６ｘ１０。７ｃｆｉｇｍｌ）提高了４．３倍左右，同时优化后每克干物质含菌数５．５７ｘ１０１０。由此可知，预测模型能较好的反应发酵的实际情况。表３．９验证实验Ｔａｂｌｅ３．９Ｔｈｅｔｅｓｔｏｆｖａｌｉｄａｔｉｏｎ优化后的丁酸梭菌Ｂ１清液发酵最佳培养基（ｓａｓＲＣＭ）组成为：酵母浸粉３．９％、胰蛋白胨４．Ｏ％、葡萄糖３．４％、牛肉浸膏１．５％、可溶性淀粉Ｏ．１％、ＮａＣｌ酸钠Ｏ．３％、ＫｚＨＰ０４０．２％、（ＮＨ４）２Ｓ０４Ｏ．１％、初始ｐＨ７．１。０．５％、乙华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究３．２丁酸梭菌在优化后培养基（ｓａｓＲＣＭ）中的代谢曲线３．２．１生长曲线、ｐＨ代谢曲线的测定丁酸梭菌在ｓａｓＲＣＭ中生长良好，生长曲线和ｐＨ代谢曲线见图３．９，可知丁酸梭菌Ｂ１在ｓａｓＲＣＭ培养基中４ｈ左右开始进入对数生长期，菌数呈指数增长，此期间由于酸性代谢产物丁酸、醋酸和乳酸和少量的丙酸、甲酸等作用，使培养基的ｐＨ值也随之快速下降。培养时间１２ｈ左右进入稳定期，此后菌数不再增加，ｐＨ值稳定在４．５．４．６之间。根据文献报道，丁酸梭菌培养进入稳定期以后开始逐渐形成芽孢，培养３６．４８ｈ可达到较高的芽孢转化率，本实验在培养３８ｈ时开始，每２ｈ取样通过相差显微镜观察芽胞转化率，发现其芽胞转化率较低，并且随着时间的延长，芽孢转化率并没有明显提高，见图３．１０。－４１１－－ＯＤ６５０２１．８１．６１．４｝－－＊－－ｐＨ。７．Ｓ；・・７；６．５窖１．２｛ｏ栅１ｊ翥ｏ．８｛０．６０．４Ｏ．２０Ｏ２４６８１０１２１４１６１８２０２２２４２６２８３０３２３４３６３８４０４２４４４６４８Ｓ０５２５４Ｓ６５８６０ｉｊ；｜６５．５５基ｊ４．５：４培养时间Ｃｈ）阉３．９丁酸梭菌Ｂｌ的乍长曲线和ｐＨ蓝线Ｆｉｇ．３．９ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｐＨｃｕｒｖｅｏｆＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢ１牛巾农ｎ大学２００９“№Ｉ：学忸论史】艘梭菌清被发酵Ｉ兰的日｝究图３．１０丁酸梭菌Ｂｌ的菌体形态图Ｆｉｇ３．１０ＣｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢＩ３．２．２葡萄糖代谢曲线在培养摹巾ｓａｓＲＣＭ叶１营养相对比较午富，在得到大描苗体的同时也有着不易形成芽孢的困扰，为了探索发酵过程中菌体对碳源的利用率，实验每２ｈ取样测定发酵液巾还原糖的含量，绘制图３１１。由图町以看｛“随着菌体的牛长，发酵液中的还原糖含量逐渐降低，说明外界的还原糖能有效地被菌体所利用。培养１２ｈ以后，菌３０华中农业大学２００９届硕上学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究体生长达到稳定期，而还原糖仍在被利用直到２０ｈ左右，可能有代谢产物在此阶段生成。当菌体生长２４ｈ以后，发酵液中还原糖含量小幅升高，其原因可能是由于菌体开始出现自溶，胞内有机质外漏造成。３９．００２．Ｓ０３７．００２．００避３ｓ．００嘶磊３３．００钿嚣３１．００隧１．５０窖。圳１．００§０．Ｓ０蝮２９舶２７．００２５．０００２４０．００６８１０１２１４１６１８２０２２２４２６２８３０３２３４时间（｝＇）辫３．ｎ丁酸梭菌８ｌ的时闻．残糖曲线Ｆｉ９３．１１Ｔｈｅｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒ－ｔｉｍｅｃｕｒｖｅｏｆＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢ１３．２．３间歇调节发酵液ｐＨ对生物量的影响由图３．９可知丁酸梭菌生长进入对数期的同时，ｐＨ也随之急速下降，较低的ｐＨ是制约菌体生长的一个重要因素，要实现丁酸梭菌的高密度培养，必须解除其代谢产物丁酸对其本身生长的抑制作用（史文玉，２００６），因此有针对性地解除这种抑制，实现其高密度培养，已成为研究和开发丁酸梭菌微生态制剂的关键（Ｇｌｕｓｚｅｚａ１．，２００４）（Ｋｅｎ－ｉｃｈｉｒｏＭｅｔＰｅｔａ１．，２０００）为了探索ｐＨ对菌体浓度的影响，本实验在丁酸梭菌培养８ｈ时将ｐＨ调回至７．３，继续培养１２ｈ后测定其菌体浓度。由于发酵体积扩大，厌氧条件难于控制，所以发酵结束后的菌体浓度没有达到最佳值，但是仍可以看出实验组的菌体浓度显著高于对照组（图３．１２）３１华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究Ｌ７石ＳＬ６凸。留５ＳＬＳ嘲Ｓ刊４５Ｌ４３５对照组实验组圈３．１２ｐＨ对丁酸梭菌Ｂｌ生物量的影响Ｆｉ９３．１２ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｂｉｏｍａｓｓ３．２．４优化的培养基发酵性能的比较实验将丁酸梭菌Ｂ１置于初始发酵培养基、ｓａｓＲＣＭ和孔青的培养基中，在同样的培养条件下（见２．２．１）进行发酵，采用２．２．２．２中的方法测算菌体浓度，得出原始发酵培养基最后得到的菌体浓度有６．９６×１０一ｃｆｕ／ｍＬ，孔青培养基最后得到的菌体浓度有１．７４×１０８ｃｆｕ／ｍＬ，而ｓａｓＲＣＭ培养后得到的菌体浓度为３×１０８ｃｆｕ／ｍＬ。可以看出，在相同条件下，本实验得到的ｓａｓＲＣＭ培养基的发酵性能高于孔青培养基，而孔青培养基得到的菌体浓度低于他之前报道的结果。分析其原因，可能是：１，因为孔青的实验是在厌氧培养箱内完成，能够达到丁酸梭菌严格厌氧的条件，而本实验只是利用石蜡液封作为厌氧条件，显然厌氧的程度较低；２，若利用孔青培养基在厌氧培养箱中培养能达到其报道水平，那么利用ｓａｓＲＣＭ培养基培养则会达到更高的菌体浓度。３２华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵Ｔ艺的研究３．５３２．Ｓ２１．ｓ１Ｏ．Ｓ０原始培养基孔青培养基优化培养基图３．１３丁酸梭菌Ｂｌ在不同培莽基中的发酵性能Ｆｉ９３．１３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆＣｂｕｔｙｒｉｃｕｍＢ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍ３３华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究４总结与讨论４．１总结本研究从华中农业大学农业微生物学国家重点实验室发酵工程室保藏的丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）Ｂ１菌株出发，通过筛选常见的可溶性的碳氮源得到能够产生较高生物量的清液发酵培养基，并对其在清液培养基中的生长性能做了较系统研究。具体完成的工作如下：１．丁酸梭菌清液发酵培养基优化首先采用单因素实验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸膏。在此基础上，利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计对影响生物量的因素进行评价，筛选出具有显著效应的葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉等三个重要因素。然后用最陡爬坡路径逼近最大生物量区域，最后利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化。结果表明葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉最佳浓度分别为３．４％（ｗ／，ｖ），４．０％（ｗ／ｖ），３．８％（ｗ／ｖ）。优化后培养基组分为：葡萄糖３．４％（ｗ，ｖ），胰蛋白胨４％（ｗ／ｖ），酵母浸粉３．８％（ｗ／ｖ），牛肉浸膏１．５％（Ｗ／ｖ），可溶性淀粉０．１％（ｗ／ｖ），ＮａＣｌｏ．５％（ｗ／ｖ），乙酸钠０．３％（ｗ／ｖ），半胱氨酸０．０５％（ｗ／ｖ），Ｋ２ＨＰ０４０．２％（ｗ／ｖ），（ＮＨ４）２８０４Ｏ．１％（ｗ／ｖ），初始ｐＨ为７．１。采用上述优化后的培养基，可使发酵液中的生物量提高到３ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ，比优化前的６．９６×１０７ｏｆｕ／ｍＬ提高了４．３倍，同时测得每克干物质的菌数为５．５７ｘ】０１０ｃｆｕ。２．丁酸梭菌在优化后培养基（ｓａｓＲＣＭ）中代谢曲线的测定（１）生长曲线、ｐＨ代谢曲线的测定丁酸梭菌Ｂ１在ｓａｓＲＣＭ培养基中是生长４ｈ左右便进入对数生长期，茵数呈指数增长，此期间由于酸性代谢产物丁酸、醋酸和乳酸和少量的丙酸、甲酸等作用，使培养基的ｐＨ值也随之快速下降。培养时间１２ｈ左右时进入稳定期，此后菌数不再增加，ｐＨ值稳定在４．５．４．６之间。本实验在培养３８ｈ时开始，每２ｈ取样通过相差显微镜观察芽胞转化率，发现其华中农业大学２００９届硕十学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究芽胞转化率较低，并且随着时间的延长，芽孢转化率并没有明显提高。（２）葡萄糖代谢曲线随着菌体的生长，发酵液中的还原糖含量逐渐降低，说明外界的还原糖能有效地被菌体所利用。培养１２ｈ以后，菌体生长达到稳定期，而还原糖仍在被利用直到２０ｈ左右，可能有代谢产物在此阶段生成。当菌体生长２４ｈ以后，发酵液中还原糖含量小幅升高，其原因可能是由于菌体开始出现自溶，胞内有机质外漏造成。（３）间歇调节发酵液ｐＨ对生物量的影响本实验在丁酸梭菌Ｂ１培养８ｈ时将ｐＨ调为７．３，继续培养１２ｈ后测定其菌体浓度，对照为静置培养２０ｈ。结果表明实验组的菌体浓度明显高于对照组，说明较低的ｐＨ是制约菌体生长的一个重要因素，要实现丁酸梭菌的高密度培养，必须解除其代谢产物丁酸对其本身生长的抑制作用。（４）优化的培养基发酵性能的对较实验将丁酸梭菌Ｂ１置于初始发酵培养基、ｓａｓＲＣＭ和孔青的培养基中，在同样的培养条件下（见２．２．１）进行发酵，采用２．２．２．２中的方法测算菌体浓度，得出原始发酵培养基最后得到的菌体浓度有６．９６ｘ１０ｃｆｕ／ｍＬ，孔青培养基最后得到的菌体浓度有１．７４ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ，而ｓａｓＲＣＭ培养后得到的菌体浓度为３ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ。可以看出，在相同条件下，本实验得到的ｓａｓＲＣＭ培养基的发酵性能高于孔青培养基，而７孔青培养基得到的菌体浓度低于他之前报道的结果。分析其原因，可能是：１，因为孔青的实验是在厌氧培养箱内完成，能够达到丁酸梭菌严格厌氧的条件，而本实验只是利用石蜡液封作为厌氧条件，显然厌氧的程度较低；２，若利用孔青培养基在厌氧培养箱中培养能达到其报道水平，那么利用ｓａｓＲＣＭ培养基培养则会达到更高的菌体浓度。４．２讨论本文通过对丁酸梭菌清液培养基的研究发现，发酵液中酸碱度是制约高密度培养的主要原因之一。丁酸梭菌发酵代谢产物含有丁酸、醋酸和乳酸，还有少量的丙酸、甲酸等酸性物质，这使得缓冲能力不强的清液培养基的ｐＨ值也随之快速下降，抑制了其自身的生长，所以工业上一般采用具有较强缓冲能力的大豆饼粉作为有机３５华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究氮源。但是相对而言，清液发酵的优势在于其后处理工艺比较简单，通过离心就能得到大量的菌体，使得包被成本和低温贮藏费用大大降低。可见，有针对性地解除这种抑制，实现其高密度培养，已成为研究和开发丁酸梭菌微生态制剂的关键。近几年该领域已经取得了一定成果，如史文玉等采用离子交换法，使发酵残液经陶瓷膜过滤，在经过离子交换树脂脱酸后重新补充新鲜培养基打入发酵罐中进行循环使用，大大降低了原发酵液中丁酸的抑制作用，大幅度提高了菌体浓度。此外，虽然丁酸梭菌在进入对数生长时剧烈产气，但是在培养最初的８ｈ是需要严格厌氧的，本实验改良的厌氧培养方式（见２．２．１）要求培养基使用前应置于沸水浴１０ｍｉｎ驱氧，待冷却至５０℃左右进行接种（若冷却到室温则会有氧气再次溶入），所以接种时温度目前仅凭个人感觉，而非精确地判断，难免会对实验结果造成误差，目前此方法只能保持同批次内实验结果的稳定性，不同批次的实验结果仅能反应某种趋势以供参考。在两种培养基发酵性能对比实验中可以看出，孔青的培养基在本实验条件下发酵得到的菌体浓度是在厌氧培养箱培养的１／５，那么可推断出，丁酸梭菌使用ｓａｓＲＣＭ培养基在培养箱中厌氧培养，菌体浓度还会有大幅提高。丁酸梭菌在严格厌氧下培养，其产生的内生芽孢才能具备抗氧能力。所以丁酸梭菌培养的关键问题就是要在获得较高菌量的同时提高芽孢转化率。芽孢生成是菌体正常生活史中的一个阶段，是一种积极的状态变化过程，此过程应是在适宜的培养环境中菌体生长良好的条件下由多方面因素协同作用的结果。本实验初步研究了丁酸梭菌对还原糖的利用情况，发现当还原糖含量较低时，菌体浓度也较低，当还原糖含量较高时，菌体浓度大幅提高，但还原糖的利用率不到５０％，此前也有文献报道，充足的可发酵碳源对丁酸梭菌的生长极为重要（施曼玲等，２００１），所以如何在发酵后期降糖促进其生成芽孢这一问题也有待解决。丁酸梭菌是人体的正常肠道菌，具有应用于食品工业和饲料工业的潜力，目前在防止仔猪腹泻和减轻腹泻严重程度具有显著地效果，下一步可以设计更加精密的动物实验来证明丁酸梭菌在提高免疫力、抗诱变、抑制有害酶的产生、抑制有害菌的体内繁殖、治疗大肠炎、结肠炎，甚至抑制肿瘤细胞生长等方面的作用。总之，丁酸梭菌的应用前景非常乐观，如要将其应用于食品工业或饲料工业，对其工业化生产所涉及的各方面都需进一步的研究。华中农业人学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究参考文献１．蔡武城，袁厚积．生物物质常用化学分析法．北京：科学出版社，１９８２：５９—６０２．钞海峰．添加益生素对羔羊增重效果的影响．畜牧业，２００４，３．５：８－９陈天寿．微生物培养基的制造与应用．北京：中国农业出版社，１９９５４．褚以文．微生物培养基优化方法及其ＯＰＴＩ优化软件．国外医药抗生素分册，１９９９，２０（２）：５８．６１５．６．杜晋平．益生素添加剂的作用机理．四川动物与兽医科学，２００２，２９（１１）：３２．３３方波，潘鲁青，董双林．微生态制剂在沿黄低洼盐碱地凡纳滨对虾养殖中的应用研究．海洋科学，２００５，２９（１）：１—３７．韩进程，姚军虎，刘玉瑞等．酶制剂和微生态制剂对蛋鸡雏鸡生长性能的影响．中国饲料，１９９８，１０．２１．２２８．何明清，倪学勤．我国动物微生态制剂研究、开发和应用动态．饲料广角，２００２，２１：１．７９．何明清．动物微生态学．北京：中国农业出版社，１９９４１０．胡运权．试验设计方法．哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，１９９７，１５３－１５４１１．黄红卫．断奶仔猪添加微生态制剂的效果试验．湖南畜牧兽医，２００７，２：１４１２．黄云海．微生态制剂饲料养三黄鸡的效果观察．现代农业科技，２００７，５：８８．８９１３．孔青．丁酸梭菌培养与发酵动力学以及调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究．浙江大学博士学位论文，２００６１４．冷寒冰，王效禹，齐旭阳等．一株功能型益生菌对肉鸡生产性能的影响．中国微生态学杂志，２００７，１９（２）：１３９．１４１１５．李春丽，崔淑贞，惠参军等．微生态制剂对哺乳仔猪生长及免疫机能的影响．中国畜牧兽医，２００５，３２（５）：１４．１５１６．李恕，丛宁．微生物饲料添加剂．酪酸菌复合酶．渔业致富指南，１９９８，２１：２３．２４１７．李雄彪，马庆英，崔云龙．酪酸梭菌．肠道健康的卫士．上海：复旦大学出版社，２００８：３０４．３３４１８．李研东．动物微生态制剂的使用现状及应用前景．河北畜牧兽医，２００５，２１（０４）：４９３７华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究１９．刘克琳，何明清．益生菌对鲤鱼免疫功能影响的研究．饲料工业，２０００，２１（６）：２４．２５．２０．马明颖，孙会，吴斌．酵母培养物对蛋雏鸡生长及免疫机能的影响．饲料工业，２００５，２６（２１）：１７．１９２１．马曙生．ＥＭ发酵料在培育仔猪中的应用．青海畜牧兽医杂志，１９９９，２９．（２）：２３．２４２２．冉雪松，王振华，潘康成．丁酸梭状芽孢杆菌的研究进展．安徽农学通报，２００７，１３（４）：３７．３９２３．任文军．益生素饲料添加剂在牛羊饲料上的应用．畜牧业，２００４，２：２２．２３２４．施曼玲，戴赞，章玲．丁酸梭菌培养条件的研究．杭州师范学院学报，２００１，１８（４）：３８．４０２５．石现瑞，高峰．抗生素添加剂的负面效应及其代替品的研究．饲料博览，２０００，３：２４．２６２６．史文玉．代谢产物丁酸对酪酸梭菌生长的抑制研究．工业微生物年会论文集，２００６，１２：５１—５３２７．夏淑兰．现代应用微生物学实验技术．北京：轻工业出版社，１９８８，１３８．１３９２８．谢树贵，戴青，赵述淼，梁运祥．酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究．微生物学通报，２００７，３４（６）：１０４７—１０５１２９．邢宝松，王修启，张兆敏等．酵母培养物对母猪繁殖性能的影响．粮食与饲料工业，２００４，１１：３７—３８３０．徐晶，金征宇．益生菌的作用机理及其在饲料中的应用．中国饲料，２００１，１：３７．３８３１．杨桂平．丁酸菌的生物功能研究．中国微生态学杂志，１９９，１０（５）：３０６．３１０３２．尹召华，杨万玉．酵母培养物在奶牛日粮中的应用效果．安徽农业科学，２００２，３０（３）：３８９—３９１３３．余成瑶．鸡微生物饲料添加剂喂肉用仔鸡扫描电镜下的小肠粘膜的研究．四川农业大学学报，１９９４，１２（增刊）：５８５．５８７３４．张树波，崔云龙，吴顺娥等．酪酸梭菌的抑制作用研究．中国新药杂志，２００２，１１（４）：３２２．３２４３５．张雪平，陆俭，傅思武等．酪酸梭菌与双歧杆菌对肠道致病菌的体外拮抗作用．３８华中农业人学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究中国微生态学杂志，２００１，１３（５）：２６０．２６２３６．张扬，余雄，蔺宏凯等．瘤胃微生态制剂对泌乳奶牛产奶量的影响．草食家畜，２００５，２－５２．５４３７．赵建新，张瀛，田丰伟．丁酸菌的分离、鉴定及筛选．无锡轻工大学学报，２００２，２１（６）：５９７．６０１３８．钟日聪，徐春厚．饲用微生物添加剂的研究进展．饲料研究，２００７，２：９－１１．３９．朱晓慧，唐英宝，刘佳．２０００，１２（２）：１０８．１０９酪酸菌制剂活菌检测方法的研究．中国微生态学杂志，４０．Ｂａｉｒｄ．Ｄ．Ｍ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｈｅｌｐｂｏｏｓｔｆ．ｅｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，１９７７，４９：１１－１２ｏｆａ４１．Ｄｏｕｉｌｌｅｔ．Ｐ：Ａ，Ｌａｎ＃ｏｎ．Ｃ．Ｊ．Ｕｓｅｏｙｓｔｅｒ（ＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓｐｒｏｂｉｏｔｉｃｆｏｒｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｌａｒｖａｅｏｆｔｈｅＰａｃｉｆｉｃ９９：２５—４０ｏｆｔｈｅＴｈｕｎｂｅｒｇ）．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９４，１４２．ＥＪ．Ｃａｉ，ＹＬｉ，Ｚ．Ｈ．Ｘｕ，Ｈ．Ｙ，Ｘｕ，Ｋ．ｓｕｎ，Ｗ．Ｙ．Ｔａｏ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｕｍｍｙｅｄｉａｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｅｘｏ－ｐｏｌｙｍｅｒｂｙＧｒｉｆｏｌａｆｒｏｎｄｏｓａＧＦ９８０１ｕｓｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，９７：１２０９－１２１６．４３．ＦｕｌｌｅｒＲ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎｍａｎａｎｄａｎｉｍａｌｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８９，６６（５）：３６５－３７８ａｎｄｄｙｎａｍｉｃｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃＢｉｏｓｙｓｔＥｎｇ，２００４，４４．Ｇｌｕｓｚｃｚ只Ｊａｍｒｏｚ乃ＳｅｎｃｉｏＢ．Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍａｃｉｄｓａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｏｎｔｏｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅｒｅｓｉｎｓ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ２６：１８５．１９０４５．ＨａｍｂｌｅｔｏｎＲ，ＧＪＲｉｇｂｙ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｏｘｙｇｅｎｏｎｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｕｔｇｒｏｗｔｈｏｆｓｐｏｒｅｓｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７０，３３：６７４－６７８４６．ｈｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ．ｈａｎｄｏｎｇｖｅｔ．ＣＯ．ｋｒ／ｅｎｇｉｉｓｈ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ａ／ｐｒｏｄｕｃｔａ０７．ａｓｐＥｘｐｅｒｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅ４７．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／／ｐｃｓ／ｊｅｃｆｅｄｓｕｍｍａｒｙ＿５２．ｐｄ￡ＪｏｉｎｔＦＡＯ／ＷＨＯｏｎＦｏｏｄＡｄｄｉｔｉｖｅｓＦｉｆｔｙ－ｓｅｃｏｎｄｍｅｅｔｉｎｇＲｏｍｅ．２－１１Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９９Ｓｕｍｍａｒｙａｎｄｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ４８．Ｋ．Ｎ．Ｎｉｌａｄｅｖｉ，Ｋ．Ｓｕｋｕｍａｒａｎ，ＮｉｃｅｍｏｌａＪａｃｏｂ，ＧＳ．Ａｎｉｓｈａ，Ｐ．ＰｒｅｍａＲａｊｅｅｖ．ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｌａｃｃａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｎｏＶｅｌｓｔｒａｉｎ—Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｓａｍｍｏｔｉｃｕｓｕｓｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１０：１－９４９．Ｋｅｎ－ｉｃｈｉｒｏＭＹＫａｚｕｙｕｋｉＳ，Ｋａｉｍｉｎｇ．ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｖｉｔａｍｉｎｒｅｃｙｃｌｅＢ１２ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｙａｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｙｃｅｌｌ３９ｓｙｓｔｅｍａｎｄｍｉｘｅｄｃｕｌｔｕｒｅ．华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＪｏｕｒｎａｌ，２０００，６（３）：２０７—２１４５０．Ｌｅｖｙ．Ｓ．Ｂ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｉｎａｃｔｉｏｎ．ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，２００１，３３：１２４－Ｓ１２９５１．ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙＤＣ．ＤｅｓｉｇｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．３衄ｅｄ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．１９９１５２．ＮＡＲＩＴＡａｎｄＭ。ＨＵＡＮＧＣＣ，ＫＯＩＺＵＭＩ刀ＹＡＭＡＧＡＴＡ巧ＥＮＤＯａｎａｅｒｏｂｉｃＧＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｓｏｌａｔｅｄ１４Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｅｒｃｕｒｙ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｍｅｒｃｕｒｙ－ｐｏｌｌｕｔｅｄｓｅｄｉｍｅｎｔ．ＷａｔｅｒＳｃｉ＆Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，４２（３—４）：１０９－１５３．ＰＡＲＫＥＲＡＣ．Ｎｏｎ－ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎｓｏｉｌ．Ｉ．Ｓｔｕｄｉｅｓｂｕｔｙｒｉｃｕｍ．ＡｕｓｔｒａｌｉａｎｏｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９５４，５（１）：９０—９７ｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｅｅｄａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎ５４．Ｐｏｌｌｍａｎ．Ｄ．Ｓ，Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ．Ｄ．Ｍ，Ｐｏｅ．Ｅ．Ｒ．ＥｆｆｅｃｔｓＤｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｓｔａｒｔｅｒａｎｄｇｒｏｗｉｎｇ—ｆｉｎｉｓｈｐｉｇｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９８０，５１：５７７．５８１５５．ＸｉａｏｙｉＷａｎｇ，Ｂｏｊｉｎ，ＤｅｎｎｉｓＭｕｌｃａｈｙ．ＩｍｐａｃｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙａｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｈｙｄｒｏｇｅｎｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍＷ５．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｙｄｒｏｇｅｎＥｎｅｒｇｙ，２００８，３３：４９９８－５００５华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究致谢本论文是在导师梁运祥教授的悉心指导下完成的。三年前，梁教授将我收入门下，三年来梁老师在工作和生活上都给予了无微不至的指导和关怀。我的论文从选题、方案设计、实验实施到论文的最终完成，无一不凝聚着导师的心血和汗水。梁老师谦逊宽厚、学识渊博、治学严谨、视野开阔，追求创新。梁老师的那种敬业精神深深的感动着我、激励着我、启发着我，使我受益匪浅。在此，谨向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢！感谢导师三年来在生活和学习上给予我的关心和帮助！感谢导师的知遇之恩、培育之恩！本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。感谢葛向阳副教授、王绩高级工程师、陈正军、梅余霞、胡咏梅、赵述淼等老师及罗露、唐堂、周琪、叶倩、严鹤松、徐倩、谭光迅、廖东栋、徐维峰、王小曼等同学的支持与帮助，我从这些关心和帮助我的老师和同学身上学到了很多，也受到了很多启迪。我非常留恋我们在实验室融洽相处、互相学习、取长补短的那段美好时光，这段经历终生难忘，在此之际，一并对他们表达最为真挚的感谢！生命科学技术学院２００５级本科生张晶同学参与了本论文部分实验工作，对她的辛勤劳动表示感谢！特别感谢呵护我成长的父母。回顾２０多年来走过的路，每一个脚印都浸满着他们无私的关爱和谆谆教诲，６年的在外求学之路，寄托着父母对我的殷切期望。他们在精神上和物质上的无私支持，坚定了我追求人生理想的信念。父母的爱是天下最无私的最宽厚的爱。大恩无以言报，惟有以永无止境的奋斗，期待将来辉煌的事业让父母为之骄傲。我亦相信自己能达到目标。感谢所有关心和支持我的各位老师、同学、朋友和亲人们！谨以此文献给他们。徐莹２００９年５月于武汉４１华中农业大学２００９届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究附录作者介绍徐莹，女，１９８４年１１月生，天津人。２００３年９月进入华中农业大学生命科学技术学院就读于国家生命科学与技术人才培养基地；２００６年９月，经免试推荐进入华中农业大学农业微生物学国家重点实验室攻读发酵工程硕士学位，研究方向为微生物产品及发酵工艺。２００７年６月获得理学学士学位，２００９年６月获得工学硕士学位。发表论文情况徐莹，梁运祥．响应面法在丁酸梭菌清液发酵培养基优化中的应用．湖北农业科学（已接收）４２